Способ отбора высокотриптофановых генотипов кукурузы

/04 и А П НИЯ ственный единения В,Глуш- . чески укуруз аспекты - Киши ледо И. -качествячменя.с,116-126 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ИЕ ИЗОБР К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(56) 1. Палий А.ф. Генетиулучшения качества зерна кнев: Штиинца, 1989, с,б 2,2. Методы . биохимическогония растений./Под ред. ЕрмакоАгропромиздат, 1987, с.277-279.3, Цариченко А.П. Селекциябелка в зерне пшеницы, кукурузКраснодар, НИИСХ, 1977, вып,12 Изобретение относится к биотехнологии, к генетическим исследованиям зерновых культур и может быть использовано в селекции и семеноводстве для отбора перс- пективных форм кукурузы с улучшенным качеством зерна,Кукуруза является одной из основных зернофуражных и пищевых культур, Однако, наряду с высокой продуктивностью кукурузы, ее зерно отличается несбалансированностью аминокислотного состава. Одним из показателей, снижающих питательную ценность зерна кукурузы, является низкое содержание триптофана, В связи с этим большую практическую значимость приобрели селекционно-генетические приемы улучшения качества зерна кукуруэы путем повышения содержания(54) СПОСОБ ОТБОРА ВЫСОКОТРИПТОФАНОВЫХ ГЕНОТИПОВ КУКУРУЗЫ (57) Использование: биотехнология, сельское хозяйство, биохимия растений, селекция и семеноводство, Сущность изобретения: облучают исследуемый образец зерна кукурузы ультрафиолетовым светом. определяют спектр флуоресценции, находят максимум флуоресценции и по его положению в интервале длин волн 326-330 нм идентифицируют высокотриптофановые формы. 1 з.п,ф-лы, 6 табл. триптофана (1, С решением этой важной задачи неразрывно связана разработка способов отбора перспективных селекционных форм кукурузы с повышенным содержанием триптофана в зерне.Известны способыотбора, включающие проведение щелочного или ферментативного гидролиза образца муки, обработку полученного гидролизата цветореагентом, измерение оптической плотности окрашенного раствора, определение количественного содержания триптофана по калибровочной зависимости и проведение отбора форм кукурузы с улучшенным качеством зерна в сравнении с контролем (2).Недостатки указанных способов - длительность процедуры гидролиза образца муки, трудоемкость проведения анализа с5 10 15 20 30 40 50 55 использованием большого набора дефицитных и токсичных химических реагентов,Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому эффекту является способ, включающий гидролиз образца муки под действием проназы, обработку гидролизата раствором и-диметиламинобензальдегида, измерение оптической плотности окрашенного комплекса с последующим отбором высокотриптофановых образцов по результатам анализа,Согласно способу навеску образца муки (500 мг) смешивают с суспензией фермента проназы при рН 7,4 (значение рН поддерживают прибавлением насыщенного раствора бикарбоната натрия). Уидролиз проводят в течение 48 ч при 37-390 С в термостате параллельно для анализируемого, контрольного образцов и суспензии фермента (контроль фермента). Гидролизаты охлаждают и центрифугируют в течение 30 мин, К пробе гидролиэата прибавляют 50 ьный раствор и-диметиламинобензальдегида в концентрированной соляной кислоте,1 Д-ный раствор нитрита натрия и выдерживают 15 мин, Окрашенные растворы фильтруют и Определяют оптическую плотность на фотометре для исследуемого образца, контроля образца и контроля фермента. Количественное содержание определяют по калибровочной зависимости, полученной путем анализа стандартных растворов триптофана. Отбор высокотриптофановых форм кукурузы проводят в сравнении с контрольным образцом зерна (31 Недостатки известного способа-длительность проведения гидролиза образца муки(2 сут). необходимость поддержания в процессе гидролиза установленной температуры и величины рН, использование в процессе анализа растворов реагентов в концентрированной соляной кислоте, что существенно ограничивает применение способа для массовой оценки селекционного материала и не дает возможности проведения экспресс-диагностики.Целью изобретения является упрощение и ускорение отбора,Способ осуществляется следующим образом,Срез зерна или муку образца кукурузы помещают в кювету спектрофлуориметра, облучают ультрафиолетовым светом при длине волны 270-285 нм измеряют спектр флуоресценции образца в области 290-360 нм и определяют положение максимума флуоресценции. При положении максимума в интервале длин волн 326-330 нм проводят отбор высокотриптофановых образцов кукурузы. Интервал значений длин волн возбукдения (270-285 нм) и флуоресценции (326- 330 нм) обоснован экспериментально,Отличительной особенностью способа является использование в качестве образца среза зерна или размолотого зерна кукурузы и проведение отбора по флуоресцентным параметрам образца.П р и м е р 1, Срез зерна кукурузы помещают в кювету спектрофлуориметра МРФ, облучают его ультрафиолетовым светом при длине волны 281 нм, измеряют спектр флуоресценции образца в области 290-360 нм и определяют положение максимума флуоресценции по результатам анализа 3-5 индивидуальных эерновок каждого сортообразца, В качестве контрольных образцов используют зерно исходных линий кукурузы (+/+), а в качестве вь 1 сокотриптофановых - зерно линий кукурузы, мутантной по гену опейк - 2 (о 2/о 2), Параллельно проводят определение триптофана в зерне известным способом. Полученные данные свидетельствуют о том, что для контрольных образцов максимум флуоресценции находится при 314-315 нм, тогда как установленные значения для высокотриптофановых аналогов достоверно выше и характеризуются интервалом 326-329 нм,В табл.3 приведены значения максимумов флуоресценции срезов зерна и содержание триптофана.в зерне контрольных и высокотриптофановых образцов кукурузыП р и м е р 2. Аналогично примеру 1 проводят определение максимума флуоресценции размолотого зерна кукурузы при различных значениях длины волны возбуждения для контрольного (Я 155+/+) и высокотриптофанового (%155 о 2/о 2) образцов.В результате эксперимента установлено, что оптимальным интервалом, при котором возможен достоверный отбор высокотриптофановых аналогов, является область длин волн возбуждения 270-285 нм, При значениях длины волны возбуждения меньше 270 нм уменьшается точность определения максимума флуоресценции из-за снижения его интенсивности, а при значениях длины волны возбуждения выше 285 нм уменьшаются различия между параметром контрольного и высокотриптофанового образцов и, тем самым, снижается достоверность отбора.В табл.2 приведены данные о зависимости флуоресценции размолотого зерна контрольных и,высокотриптофановых образцов кукурузы от длины возбуждения.П р и м е р 3. Аналогично примеру 1 проводят определение максимума флуоресценции образцов размолотого зерна кукуру1741676 Таблица 1 зы исходной линии ЧЧ 64 А +/+ и эндоспермовых мутантов типа о 2/о 2, ы 2/зц 2, о 2/о 2 зц 2/зо 2 при длине волны возбуждения 281 нм, Установленные значения максимума флуоресценции (табл.З) показывают сте пень влияния различных эндоспермовых мутаций на изменение триптофэна в зерне.П р и м е р 4. Аналогично примеру 1 проводят измерение при длине волны возбуждения 281 нм и устанавливают вариа бельность максимума флуоресценции для срезов зерна исходной линии кукурузы Сг 2 +/+ и эндоспермовых мутантов типа о 2/о 2, щх/ах, о 2/о 2 ах/вх. Результаты даны в. табл.4. 15П р и м е р 5, Аналогично примеру 1. определяют значения максимума флуоресценции при длине волны возбуждения 281 нм и проводят оценку высокотриптофановых образцов муки двойных мутантов типа 20 о 2/о 2 зц 2/за на основе различных исходных генотипов кукурузы.В табл,5 приведены значения максимумов флуоресценции размолотого зерна эндоспермовых мутантов кукурузы, 25 П р и м е р 6. Аналогично примеру 1 проводят определение максимума флуоресценции при длине волны возбуждения 281 нм для срезов зерна гетерогенного селекци онного материала. В данном случае использованы семьи третьего года самоопыления (Яз), которые получены во ВНИИ кукурузы из 16 линейных синтетиков кукурузы, содержащих в своем генотипе мутант ный ген опейк. Полученные результаты приведены в табл.б и показывают возможность проведения диагностики высокотриптофановых форм на гетерогенном селекционном материале, 40 Использование предлагаемого способа в сравнении с прототипом позволит существенно упростить и ускорить проведение отбора путем исключения длительных и трудоемких операций по оценке содержания триптофанэ в зерне. При этом предлагаемый способ полностью исключает использование химических реагентов.Установочный маркерный признак дает возможность проводить позерновочный экспресс-анализ без разрушения зерновки, что является важным при диагностике селекционного материала с ограниченным выходом зерна. Проведение отбора с использованием параметров флуоресценции позволит вь 1 явить высокотриптофэновые формы при генотипической вариабельности воздействия различных эндоспермовых мутаций, а также при практической селекции кукурузы с улучшенным качеством зерна.Формула изобретения 1. Способ отбора высокотриптофановых генотипов кукурузы, включающий определение оптических параметров исследуемых образцов и идентификацию высокотриптофановых форм, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения и ускорения отбора, исследуемые образцы предварительно облучают ультрафиолетовым светом при длине волны 270-285 нм; в качестве оптического параметра определяют спектр флуоресценции при длине волны 290-360 нм, находят максимум флуоресценции и по его положению в интервале длин волн 326-330 нм идентифицируют высокотриптофановые формы.2. Способ по п,1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что в качестве исследуемых образцов используют срезы зерна или размолотое зерно кукурузы.1741676 Продолжение табл. 6 Составитель В.ФеденкоРедактор И.шмакова Техред М,Моргентал Корректор М.Дем оизводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 аказ 2229 ВНИИП Тираж Государственного комитета по изобретен 113035, Москва, Ж, РаушскаПодписноеям и открытиям при ГКНТ ССнаб 4/5