Способ аэробной и анаэробной ферментации

СО 03 СОБЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКРЕ СПУБЛИК 1707 БРЕТЕНИЯ ЕИ ЛЬСТВ ОРУ СВ К АВ нное гидролиэноером"Поляк, Д Д.Савельв, И,Г.Штепенко и оцэ аеоЬоГптоо 1 Игеб ов,3 цм, соп 1 В 1 о 1 еспп о,и о еьапсЕог, .1. йрр 3, р,148-151 Изобретение относится к микробиологической прол",ышленности, в частности к поозводствам з-энола, фуранкарбоновой кислоть:. антибиотиков, биомассы дрожжей, ферментов и других продуктов трансформации ооганических субстратов иммобилизованными клетками микроорганизмов,Использование иммобилиэованных клеток е аэробной и анаэробной ферментации позволяет более эффективно использовать каталитические свойства1 микроорганизмов: появляется возможность создания непрерывно действующих стабильных процессов беэ затрат на получение и выделение биомассы.Известеч способ анаэробной ферментации с использованием иммобилиэованных дрожжевых леток для получения этанола, В этом способе клетки 5 асс)агогпусев ГОСУДАР Ст Е Е ННЫ И КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР(57) Изобретение относится к микробиологической промышленности Цель изобретения - повышение активности продуцента, снижение затрат на приготовление носителя и унифицирование оборудования, Цель изобретения - увеличение выхода продукта и упрощение способа. Для этоо закрепление клеток производят в пене на л 1 ежфазчай поверхности гаэ - жидкость при удельных затратах мощности на создание межфазной поверхности от 0,5 до 3,0 кВТ/м ч. При этомздля проведения аэробной ферлентации используют барботаж воздухом а аназробчой - барботаж рециркулируел ым в фермечтаторе газом 2 табл. сегеу 15 ае включают в отосшиваемые смолы, поляризация которых происходит под действием света 300 - 400 нм. Гелевые пластинки толщиной 0,8 - 1,0 мл укладывают вертикально в реактор непрерывного действия, В качестве субстрата подают разбавленную тростниковую мелассу, В установке, оборудованной таким образом, выход сп рта составляет 600 л/день (1.Однако продуктивность реактора постепенно снижается из-за накопления в нем осадка мелассы, который необходимо периодически удалять.Известен также способ анаэробной ферментации для получения этачола с использованием дрожжевых клеток, юлмобилизованных в пектине Для иммобилизации клеток 5. вегеив 1 ае СМ-20 равные обьемы пектина и дрожжевой суспензии вводят есмесь 0,2 М МагВлОт. Концентрац и дрожжей в пектине и в исходной суспензии обыч. но равны 70 г/л сухой массы и 2 - б об.массы соответственно. При сбраживании глюкозы иммобилизованными нэ твердом носителе клетками максимальный выход этанолв составляет 0,43 г/л глюкозы, а продуктивность 12 кг/м ч 2.Недостатками способов аэробной и анаэробной ферментации, включающих инкубацию субстратов с иммобилизованными на твердых носителях клетками, являются снижение активности клеток биомассы при закреплении на носителе иэ-за затрудненного доступа субстрата и кислорода при аэробных процессах и недостаточной вентиляции при анаэробных процессах, необходимость регенерации носителя, загрязнение носителя осадками субстрата и необходимость удаления осадков; неконтролируемость количества биомассы на матрице и ограниченная скорость потока через носитель, а также необходимость специального оборудования для накопления биомассы продуцента, приготовления носителя и ферментации.Целью изобретения является увеличение выхода продукта и упрощение способа,Указанная цель достигается тем, что согласно способу эзробной и анэзробной ферлентации вк;ючающему инкубэцию субст;,атовс ил о и",и:ованными клетками и последующее от,"е- ние продуктов реакции, использукт клетки. обладающие флотирующей способностью, а их иммоб изац ю осуществляют путем закрепления клеток нэежфазной поверхности газ - жидкость -.ри удельньх затратах мощности 0,5 - 3 кВт.м ч, при этом для иммобилизации при проведении азробной ферментации используют барботаж воздухом, а при проведении анаэробной - барботаж рециркулируемым в ферментаторе гдэОм.Способность клеток эдсорбироваться на поверхности раздела фаз газ - жидкость известна и и пользуется при выделении клеток из культуральной жидкости методом флотэции. Флот р, ощей способностью обладают дрожже одсб ье грибы рода Сапогэ, ТгсЬозрогоп Напзепоа, Киу 1 егоптусез, Азре ц з б. ег,и Васоз озсз, базидальнье гр бы Тгс 1 обегггэ итотот и другие,Зтэ способность микроорганизмов используется для их иммобилизации на поверхности фэз газ - жидкость,В предлагаемом способе клетки закреплень на поверхности раздела фаз в пленках жидкости, окружающих пузырьки, и не обладают способностью свободно передви 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 гаться в основном объеме жидкости, Об этом свидетельствует полное отсутствие клеток в жидкости, выводилой из аппарата, несмотря на их значительную концентрацию в объеме реактора (12 - 40 г/л абсолютно сухой биомассы) и высокие скорости протока среды (О - 1-2 ч 1).Среди известных способов ээробной и анаэробной ферментации, включающих инкубацию субстратов с иммобилизованными клетками и последующее отделение и родуктов реакции, не обнаружено признаков, сходных с отличительными признаками предлагаемого изобретения.В отличие от способа аэробной и анаэробной ферментации с использованием традиционной иммобилизации натвердых носителях, где поверхность раздела фаэ фиксируют, создание поверхности раздела фаз в системе газ - жидкость требует введения энергии на диспергирование газа, так как такая двухфазная система обладает только динамической устойчивостью и в отсутствии подвода энергии нэ перелешивание рассла вается с образованием газовой и жидкой фаз, Для создания и поддержания раздела фаз е зависимости от пенообразующей способности раствора требуется различный вклад мощности на перемешивэниеУвеличение выхода продукта в предлагаемом способе ээробчой и энароб ой ферментэции обус" овлечо .оеыще ие;л экгиэности гродуцентэ по ссэв е ию сз ггособом. где используют и ллобилиза.ию нэ твердых носителях, так кэк в предлагаемом способе субстрат, кислород и другие колпоненты среды абсолютно доступны к,-=тке и последняя не ингибируется химическими соединениями, применение которых неизбежно при формировании теердых носителей. Поверхность раздела фаз газ - жидкость не загрязняется осадками субстратов и способствует активнолу мэссообмену газов.Для накопления биомассы продуцЕнтов, провсдения процесса иммобилизации и получения продуктов не требуется специального оборудования, а все три процесса протекают в одном ферментаторе. Унификация оборудования. а также снижение затрат на приготовление носителя достигается тем, что для аэробных и аназробных процессов требуется один ферлентатор, с той лишь разницей, что при проведении аэробных процессов используется воздух, э анаэрсбных - С 02, любой инертный газ Все указанное приводит к упрощению предлагаемого способа.Иммобилизованные к четки микроорга- низмов на поверхности раздела фаэ газ -. идкссть используют в азробном процессе биотрансфорглации фурфурола (Ф) в фуранг-коб,човую кислоту (ГФКК), в аэробном процессе очистки сточных вод и аназробно л процессе сбраживания сахаров на спирт.Ферментацию проводят с различныгли видами микроорганизмов из музея ВНИИ- гидролиз в ферментаторе емкостью 3 л при определенном вкладе мощности на создание межфаэной поверхности газ - жидкость, снабженном мешалкой, системами подачи воздуха, те: статирования подачи субстрата и отбора культуральной жидкости через зону, лишенную подвода энергии переглешивания.Зона, лишенная подвода энергии, создается искусственно, в виде кармана или ложного дна ферглентэтора. В этой зоне происходит расслоение на газовую и жидк, ю фазы, Микроорганизмы, закрепленные на поверхности пузып ов, всплывают в активну о зону ферглег ра, а культуральная жидкость, свободная от клеток и содержащая целевой продукт, выводится из зоны, лишенной энер и.6 ферглентатор непрерывно подают питатсл;н.д;. средь;аз. тоддерж вают температуру и рН. Одновременно с подачей гитательнсй сред. щ ствляют непрер:явнаи стбос к."ту; эльной жидкости из ззны лишенной пздв".-.а зчегии. Удержание биомассы а фермечтаторе осуществляют за с ет им об,1 лг за ии клеток на поверхности раздела 4; аз жидкость. 6 культуральной жидк.-ти определяют концентрацииии продуктов глетодом ж идкос гной хроглатографии, спекрофотометрически, химически.Осуществляя способ аэробной и анаэробной ферментации с использованием клеток, обладающих 1,лотирующей способностью, иглмоб 1 изованных на глежфазной поверхности газ - жидкость, накопление биолассы продуцента и биотрансфорглацию фурфурола иглмобилизованными клетками пооводят в одном ферментаторе.П р и м е р 1, Дрожжи Сэпсса тгорсэв 649(У) вносят в ферментатор с питательной средой, а активную зону которого непрерывно подают воздух и осуществляют активное перегле 1 ц ивание среды с помощью глешалки (М = 500 мин ) для создания межфазной поверхности газ - жидкость, Вклад мощности на перемешивание 1,2 кВт/м по 3 верхности, на которой удерживаются клетки дрожжей. При достижении концентрации биомассы в ферглентэторе 12 г/л вместо питательной среды начинают подачу раствора Ф с концентрацией 1,5, Из зоны фермен 10 15 20 25 30 35 40 4550 55 татора, лишечной под.-здэ: ч агин о 5 ра.ют культуральную жидкость без биомассыпродуцента, в которой Ф окислен до ГФККПроцесс биотрансфорглации Ф протекаетпри 37 С и рН 6,0 Скорость подачи раство.ра составляет 0 = 0 2 чВыход целевого продукта - ГФКК составляет 95 ь. Процесс трансформацииосуществляют непрерывно в течение 120 ц,концентрация биомассы в ферментаторе составляет 12 г/л, а в культуральной жидкости- 0,12 г/л.П р и м е р 2, Накопление и иглл 1 обилизацию продуцента ФКК "рожжей Напсеппаапоп 1 эа Кир(У) и тоансфор лацию Ф вГФКК осуществляют по методике примеГа1, Выход ГФКК 94,3 ф, Унос клеток продуцента с культуральной жидкостью составляет 0,12 г/л сухой биомассы, концентрацияиммобилизованных дрожжей в ферглентаторе 11,8 г/л,П р и м е р 3. Накопление и ил 1 лобилизацию продуцента ФКК дрожжей Сапссагпеи Георг(70) (штамм не депснирован)осуществляют по методике примера 1 Выход целевого продукта 88 . Унос клетокпродуцента с культуральной жидкостью0,20 - 0,30 г/л, концечтрация иммобилизованных дрожжей 11 г/л,П р и м е р 4. Накоплен е и иммобилиз а ц и ю и р о д у ц е н т э Ф К К С а и сс э9 цеггпопс 3 Лу(У) и биотрансфс,"л ацию Ф в ФКК осуществляют по л 1 етэдикеприл 1 ера 1. В ыхсд це 1 евого продукта 90.0,Унос клеток про:уцента с культуральнсйжидкостью 0,23 г/л сухой биомассы, концентрация иммобилизсванных дрожжей 12г/л,П р и м е р 5, Анаэробную ферментациюсбргживаемых сахаров гидролизатэ древесины проводят при помощи иглглобиизованных в пене на межфазной поверхностигаэ - жидкость клеток дрожжей С. тгорсав649 (У). Межфазную поверхность создают в ферментаторе с мешалкой пуи удельных затратах мощности 0,5 кВт/м,В аппарат, снабженный мешалкой с отношениемапаЕаябмещалкии числом оборотов и = 125 мин, а такжесистемами подачи воздуха и рециркуляциигаза, заливают 1 л питательного субстрата -гидролизатэ древесины, содержащего 6,9г/л гексоз и 2,3 г/л пентоз,В посевную среду. содержащую 420мг/л азота и 70 мг/л Р 20 ь, вносят дрожжевые клетки С, тгорсаз 649(У). Иммобилизация клеток происходит одновременнО си, мэпплением в ээробной стади на меж. -,Н Сй ПОВ ГхнсстИ ГЭЗ - ждКОСтЬ. Созда.лэ.к л,ч гчет подач возду,а со скоростью 1 л, .работы кела,ачки (и = 15 мм ), хсмцентраця составляет 12,6 г/л сухих 5 д;,",ч жейПрпереходе на анаэробный процесс Сбрэжиеэмия гидролизата влесто подачи воздуха начинают рециркуляцию углекислого газа. образующего при сбраживании 10 гидролизата Сбраживание сахаров гидролизэта на спирт происходит при 32 С, рн 4,0, подаче субстрата со скоростью О = 1,0 ч .-1Выход этанола составляет 0,46 г/г от сброженмых редуцирующих веществ (РВ) 15 гидролизэтаКонцентрация бомэссы в культуральнсй жидкости, отбираел 1 ой из зоны, лишенной подвода энергии. составляет 0,1 - 0,25 г/л, 20П р и к е р 6 По методике примера 5 почуяэют этамсч прпомощи иммобилизованмых на к ежфазной поверхности газ - ж дкость клеток К 1 аучеголчусев гпагх 1 апнв УС, При вкладе мощности на создание меж фаэной поверхности гээ - жидкость 1,5 кВт/м вьход спирта составляет 0,42 г/г,зкМНЕмтраця бОМаССЫ В КуЛЬтураЛЬНОй жидсо.т составляет 0,5 г/л.П р и м е р По ме одике примера 5 30 пс;,чают этэмсч при помощи ик;мобилизовэнмьх нэ межфазной поверхности гаэ - ждког ьчетс С т(ор 1 са 1 в ОН-"(штамм не д помГю-"э-) П;вкл г; к.с.цности на Созхчэми межфазмой поверхности газ - жид кость 1,5 кВт/м выход спирта составляет 0 36 г/г, а концентрация биомассы в культурэльмой жидкости составчяет 0,1 - 0,18 г/л.В табл.приведены рсзультаты других амаэробмых Фермемтэцигидролизата 40 древесины и мелассгя и мобилизованными клеткамиП р и м е р 8. Очи.тку сточных вод гидролизного гроизводства проводят путем аэробного культивирования Тг. Снтапенпч 45 Лд(У 491). Процесс проводят в лабораторном ферментат ре емкостью 5 л, число оборотов мешалки 1400 мин . расход воздуха 2 л/ч. Вклад мощно ти на перемешивание 3,0 кВт,м; рН среды 5 5, 1 = 36"С; скорость 50 подачи сточной воды О = 3.0 ч концентраця б омассы в ферл ентаторе 9,5 г/л сухой бомассы, концентрация загрязнений на входе по ХПК 6000 мг 02/л.Очщенную сточную воду отбирают иэ 55 эоны ферментатора, лишенной подвода энергии в коляестве 13,5 л/ч, концентрация биомассы в ней составляет 0,1 - 0,2 г/л сухой биомассы. ХПКост = 2000 мг 02/л. Избыточную биомассу отбирают из верхней части ферментэтора с копн.мтрацией 9.5 г/л с потскок ждкости 1 5 л/ч, Глубина очистки составляет 66 - 704 (по ХПК) Удельная окислителмая мо,цность 12 г О:/и чП р и м е р 9 Очистку воды гидроч( змодрожжевсгс прозводства производят ассоциацией культур мнроорганизмсв Аьрег 9111 ов п 19 ег и реп 1 С 1 И 1 нп 1 спг 1 ьо 9 епигл (не депонированы) по методике примера 8, Концентрация загрязнений на входе по ХПК 6700 мг 02/л. Глубина очистки 75-78 О(, (по ХПК), удельная окислительная мощность системы 9,2 02/л ч.В табл. 2 приведены результаты других аэробных ферментаций сточной воды илмобилизованнымклетками.Как видно иэ приведенных прфлеров различных ферментаций, биомасса микроорганизмов в результате закрепления на поверхности раздла фэз газ - жидкость имеет время пребывания в обьеме ферментатопа значительно большее, чем время пребывания жидкости,Так, в при лерах 1 - 4 при биотрэнсформации Ф среднее время пребывания жидкости в ферметаторе составляет 5 ч пои времени тГэнг 4 ормации более 120 чВ при еГ=х 5 - 8 при сбрэж вэ и ( харосодержащих растворов в этгнол рэзни. цд времен "ребывамия дрожжей 2"0 ч и жидкости (1 ) еще больше Анэ г.чг ье данные пол,цены и при оч(тке стсчнь вод: 0,3":-". ч соответствеммс (гр :., 6 и 9)Сособ ф=р ентацис испол. зовам, м клеток, обладающих флотирующей споссбностью, иммоблизованных путел закрепления клеток нэ межфазной поверхности газ - жидкость может быть применен кэк для аэробных процессов (примеры 1 - 4, 8 и 9), так и амээробньх (прилеры 5 - 8) В эависимос.и от ис, ользуемсго субстрата и по пенообразующей способности вклад мощности на перемешивание, необходимой для создания поверхности раздела фаз газ - жидкость и обеспечения массообменэ кислорода, составляет от 0,5 кВт/м (для мелас 3сы до 3 кВт/м- ,чя сточных вод гидролизного производства) Процессы первчнсго накопления биомассы продуцентов во всех примерах и различные процессы с спользпванием имлобичизовамных на пояерсности раздела фаз гаэ - жидкость клеток проводят в одно л и том же ферментаторе для ээробньс и амаэробных процессов.В примерах 8 - 9 приведены ферментации с использованием флотирующихся микроорганизмов различных классов и родов, что указывает на широкую возможность применения предлагаемого способа для10 1707070 флотирующей способностью, а их иммобилизацию осуществляют путем закрепления клеток на межфазной поверхности газ - жидкость при удельных затратах мощности 5 на создание межфазной поверхности 0,5 -3.0 кВТ/мч, при этом для иммобилизации при проведении аэробной ферментации используют барботаж воздухом. а при проведении анаэробной - барботаж рециркули руемым в ферментаторе газом,получения продуктов метаболизма, биомассы и для очистки сточных вод.Формула изобретения Способ аэробной и анаэробной ферментации, включающий инкубацию субстратов с иммобилизованными клетками и последующее отделение продуктов реакции, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью увеличения выхода продукта и упрощения способа, используют клетки, обладающие таблица Концентрация биомассы г/л 1 а.с.д,) е В реактораВ унося Е ВВыходспирта,г/л РВ расходэлектроСреда длфесментацни Пример Втаим микроорганизма энергиик Вт/из Слтор 1 саНв 649 (У) о,о 0,5 12 5 Гидривзат1111(У) 0,47 О,ае г,о 1,6 гс,с 12,0 г,с З,с 11пел вс са н 1 го г Таблипаг Пример Юанны Среда для оер- иентации Глубинаочи с т им8 Концентрац массы, г/л нзио всходле ит ронергии,Вт/из уносе в реакт 8 1 52-56 Ттгсьовротод сцсапецвлдо (У 491) Сточная водагидролнзован- ных производст 5 6-70 Сточная вода 3,0 гидрогиэованных производств 2 Тг 1 соовротоп сцсвпета ЛдО (у 491) 1-О5-0,7 64-70 ,о 63-69 9,7,4 Авретет 11 пв пзе Сточная вода гндролизно.дротскевого пронзводст. 0,17-18 о,а-о,7