Способ выделения бактерий bacillus масеrаns из почвы

(71) Институтного центра У72 Н. Г.Ус ан именк себыть штамсегапз одроб- Спо(ьную ания в ерхнов прольного ельной ю куль- питель- озный госудлаГтае 1 и(и комитетпо иэос,агтепиял и откРытиямпаи Гкт сссР ИСАНИЕ И юл М:1иологии Башкирского научльского отделения АН СССРО.Н Логинов и А.И.Мелен( ) овтьев"А 9 г 1 са 1 тиг НапОЬооМ", 1 ч 427, 1973, 275, (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ ВАС 105 МАСЕВАМ 5 ИЗ ПОЧВЫ(57) Изобретение относится к микробиологии в частности к селекции микроорганизмов, и может быть использовано при выделении новых штаммов Вас 111 из гпасегапз Целью изобретения является ускорение процесса выделения, а также повышение его селекИзобретение относится к экспе тальной микробиологии в частности лекции микроорганизмов может использованО при выделении новых мов Вас 111 из гпасегапз,Известен способ выделения В гг(а предложенный Р.Яс 11 агс 11 п 9 ег и более п но разработанный .Н,МогЬгор 1 2 соб заключается в том накопите культуру получают путем инкубиров течение 4 - б дней проб, взятых с пов сти клубней картофеля и помещенных бирки, содержащие ломтики стери картофеля, Выращивание накопит культуры проводят при 37 С Чисту туру получают высевом пробы из нако ной культуры методом Коха на глюк агар и инкубацией в течение 2 су 37 С,5 Ц 1703681 Л 1 тивности, Способ осуществляют следующим образом, Накопительную культуру получают путем внесения пробы из водной суспензии образца почвы в селективную среду, содержащую, г/л: альфа-декстрин 3- 10; кукурузный экстракт 0,19-0,21; К 2 НРО 4 0,19-0 21; (МН 4)2 Н Р 04 0,19-0,21: вода до 1 л, и инкубированием ее в атмосфере М 2 при 48-49 С в течение 48-50 ч. Ч истую культуру выделяют путем высева пробы из накопительной культуры на картофельно-глюкозном агаре (КГА) и инкубированием при 48-49 С в течение 48-50 ч. Полученные на КГА изолированные однотипные по морфологии колонии микроорганизмов пересевают на мясо-пептонный агар(МПА) и идентифицируют. Способ способствует 1007(, выделению бактерий Вас 1 из гпасегапз. б табл. Данный способ не обеспечивает селективности выделения Вас.тасегапз, так как на картофельной среде хорошо развиваются Вас,зиЬ 111 з, Вас.ро 11 гпуха. Вас.сегеиз, Вас.11 сЬеп 11 оггп 1 з, Вас.с 1 гси 1 апз и другие представители рода Вас 111 из, причем наиболее сильно доминируют виды Вас.зиЬ 111 з и Вас.ро 1 утуха, что очень сильно затрудняет выделение Вас.п 1 асегапз на стадии чистой культуры.Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому эффекту является способ выделения микрс(организмов вида Вас.п 1 асегапз, включаю(ций получение накопительной культуры путем 10-дневного инкубирования в анаэробных условиях, атмосфере 1 ч 2, влажного образца почвы с периодическим (3 раза) добавлением к нему К 1 чОЗ, Чистую культуру получаютследующим образом По окон ани 1 инк"убации 1 г образца почвы суспендируют в с 1 ерильной воде и рассевают методом Коха начашки Петри, содержащие глицериновыйагар. Засеянные чашки Петри инкубируют 5при 28 С в течение 3-4 сут 3,К недостаткам способа относится то,что он длителен по времени и трудоемок,особенно на стадии получения накопительной культуры, Трудоемкость заключается в 10необходимости дискретного добавленияКИОз в образец почвы с последующим созданием анаэробных условий и поддержания определенной влажности образца почвы напротяжении 10 сут. Существенным недостатком является также то, что в накопительнойкультуре кроме Вас.гпасегапэ хорошо развиваются Вас.роугпуха и Вас сЬетдоггпв, чтоснижает селективность процесса выделения, Кроме того, способ неэффективен со 20многими образцами почв.Целью изобретения является ускорениепроцесса выделения, а также повышениеего селективности.Поставленная цель достигается тем, что 25согласно способу выделения микроорганизмов вида Вас.гпасегапв из почвы, включающему получение накопительной культуры иэобразца почвы в анаэробных условиях в атмосфере азота с последующим пересевом 30на агаровую среду, культивированием бактерий и отбором типичных колоний по культурально-морфологическим признакам,получение накопительной культуры осуществляют путем посева суспензии, приготовленной иэ образца почвы на питательнуюсреду, содержащую г/л;Альфа-циклодекстрин 3-10Кукурузный экстракт 0.19 - 0,21К 2 Н Р 04 0,19-0,21 40(МН 4)2 Н Р 04 0,19-0,21Вода До 1 лиз агаровых сред используют картофельноглюкозный агар КГА), при этом получениенакопительной культуры и культивирование 45на агаровой среде осуществляют при 4849 С в течение 48-50 ч.Способ осуществляют следующим образом,Накопительную культуру получают путем внесения пробы из водной суспензииобразца почвы в селективную среду особогосостава с содержанием компонентов, г/л;Альфа-циклодекстрин 3-10Кукурузный экстракт 0.19-0,21 55К 2 Н Р 04 0,19-0,21(Г 4 Н 4)2 Н Р 04 0,19-0,21Вода До 1 ли выращиванием в атмосфере М 2 при 4849 С в течение 48-50 ч. Чистую культуру выделяют путем высева пробы из накопительной культуры на КГА и инкубированием при 48 49" С в течение 48 50 ч. Полученные на КГА изолированные колонии микроорганизмов одного морфологического типа пересевают на мясо-пептонный агар (МПА) и идентифицируют известными методамиП р и м е р 1 (прототип).К каждому из десяти образцов почвы, произвольно отобранных в лесопарковой зоне г,уфы (диаметр образца 11 см, высота 7 см), добавляют по 2,1 г КИОз и помещают в анаэростат, Инкубирование проводят при 28 С, в атмосфере ч 2, при постоянной влажности образца, равной 55 . Через 3 и б сут к каждому образцу почвы добавляют повторно 2.1 г ККОз, Время инкубации 10 сут. Чистую культуру выделяют следующим образом: 1 г из каждого образца почвы по окончании инкубации суспендируют в 100 мл стерильной воды и полученную суспензию высевают методом Коха на чашки Петри с глицериновым агаром, состава г/л:Глицерин 1.0Пептон 1,0Дрожжевой экстракт 0,1КМОз 3,0Агар 1 0,0Вода До 1 лИнкубируют засеянные чашки Петри при 28 С в течение 4 сут, По окончании инкубации на чашках Петри получают изолированные колонии различных морфологических типов (иэоляты). Их пересевают на косяки с МПА и идентифицируют по Берги и Гордон 3,4, Результаты идентификации и количество колоний, высеянных с каждого образца почвы, приведены в табл. 1.П р и м е р 2, 1 г почвы из образцов, отобранных при тех же условиях, что и в примере 1, суспендируют в 50 мл стерильной воды и 0,5 мл полученной суспензии вносят в пробирки с 5 мл стерильной среды. состава, г/л:Альфа-циклодекстрин 5,0Кукурузный экстракт 0,2 К 2 Н Р 04 0,2(М Н 4)2 Н Р 04 0,2Вода До 1 л Пробирки помещают в анаэростат и инкубируют при 48 С в течение 48 ч в атмосфере М 2, По окончании выращивания пробы из каждой пробирки рассевают методом Коха на чашки Петри со стерильным КГА. Засеянные чашки Петри инкубируют при 48 С в течение 48 ч. По окончании инкубации на чашках Петри получают изолированные колонии одного морфологического типа. Их пересевают на косяки с МПА и идентифицируют по Берги и Гордон 3,4 Результатыидентификации и количество изолятое. высеянных с каждоо образца почвы приведены в табл. 2П р и м е р 3. 1 г почвы образца 1 суспендируют в 50 мл стерильной воды и 0 5 мл полученной суспензии вносят в пробирки с 5 мл стерильных сред, состав которых приведен в табл, 4. Инокулированные пробирки помещают в анаэростат и выращивают первую повторность при 48 С, вторую - при 49 С в течение 48 ч в атмосфере 112. По окончании выращивания пробы из каждой пробирки пересевают методом Коха на чашки Петри с КГА. Засеянные чашки инкубируют при 48 С в течение 48 ч, По окончании инкубации на чашках Петри получают изолированные колонии одного морфологического типа. Их пересевают на косяки с МПА и идентифицируют по Берги и Гордон 3,4 Результаты идентификации и количество изолятов выросших из пробирок со средами 1-17 при 48 и 49 С представлены в табл 3П р и м е р 4. 1 г почвы образца 1 суспендируют в 50 мл стерильной воды и 0,5 мл полученной суспензии вносят в пробирки с 5 мл стерильной среды 2 (см. табл, 4) Инокулированные пробирки помещают в анаэростат и выращивают при 48 С в атмосфере 112 Время инкубирования одной пробирки составляет 24 ч, второй - 36 ч, третьей - 45 ч, четвертой - 48 ч. пятой - 50 ч, шестой 72 ч. По окончании инкубации пробы из каждой пробирки пересевают методом Коха на чашки Петри с КГА. Засеянные чашки инкубируют 48 ч при 48 С. По окончании инкубации на чашках Петри получают изолированные колонии одного морфологического типа. Их пересевают на косяки с МПА и идентифицируют по Берги и Гордон 3,4. Результаты идентификации и количество изолятов выросших на КГА. представлены в табл. 5,П р и м е р 5, 1 г почвы образца 1 суспендируют в 50 мл стерильной воды и 0,5 мл полученной суспензии вводят в пробрки с 5 мл стерильной среды 2 см табл.4). Инокулированные пробирки выращивают в атмосфере М. Одну пробирку гри 50 С вторую при 49 С третью при 48 С четвертую при 45 С, пятую при 40" С. Время инкубации составляет 48 ч По окончании инкубации пробы из каждой пробирки высевают методом Коха на чашки Петри с 1 ГА Засеянные чашки Пери инкуби", о -ри 48 С в ечение 48 ч. По окончаниинкубации на чашках Петри получают изс; роеан ные колонии, которые пересеьают на косякис МПА и идентифицируют по Берги,1 Гордон 3,4 Результаты идентификации и количество изолятов, полученных на КГА представлены в табл, б.10 Использование для выращивания накопительной культуры жидкой среды с аьфациклодекстрином позволяет ускорить процесс выделения микроорганизмов вида В.гпасегапв, Процесс выделения по данному 15 способу осуществляется в течение 4 дней, впрототипе за 14 дней. Кроме этого, использование альфа-циклодекстрина в качестве единственного источника углерода и высокой температуры выращивания (48-49 С) 20 обеспечивает практически 100 селективность процесса выделения Вас гпасегапз иэ-за того, что представители этого вида наиболее хорошо приспособлены к потреблению этого углевода в анаэробных 25 условиях, при высокой температуре (4849 С), нежели другие виды микроорганизмов,Формула изобретения 30 Способ выделения бактерий Вас 111 озгпасегапз иэ почвы, включающий получение накопительной культуры из образца почвы в анаэробных условиях в атмосфере азота с последующим пересевом на агаровую сре ду, и культивированием бактерий и отборомтипичных колоний по культурально-морфологическим признакам, о т л и ч а ю щ и йс я тем. что, с целью ускорения процесса выделения и повышения его селективности.40 получение накопительной культуры осуществляют путем посева суспензии, приготовленной из образца почвы. на питательную среду, содержащую. г/л:Альфа-циклодекстрин 3-10 45 Кукурузный экстракт 0 19-0,2 1К 2 Н РО 4 0,19-0,21 (Г 4 Н 4) Н Р 04 0,19-0,21 Вода До 1 л,из агаровых сред используют картофельно глюкозный агар. при этом получение накопительной культуры и культивирование на агаровой среде осуществляют при 48-49 С в течение 48-50 ч.1703681 Таблица 1 Количество из Вас 11 о з гпасегапз 5 7 4 2 1 4 10 9 8 5 7 20 4 2 10 12 20 бб Зб Таблица 2 Количество изо, лированных колоний на глицериновом агареОбразец 11 с Ьеп Иоггп гпасегапз 8 3 4 б 7 б 4 14 17 82 блица 3 ид микрооргднизмовество из тельной 9 о 9 2 В, гпасегапз В гпасегапз В гпасегапв В гпасегапз 3. гпасегап 2 9 10 2 9 10 В. гпасегап В. гпасегап В, гпасегап Образец Количество изол рованных коЛОНИИ Нд глицериновом агаре1 2 3 4 5 б 7 8 9 10 Итого олятов идентифицированных как виды Вас 111 оз ро 1 угпуха Вас 111 ов 11 сЬеп Логгп 1 в, Колинество иэоллтов идентифицироввннык как визитыВас 1 Оз р 01 угпухд 1 Вдс 110 з ятов на КГА, высеянных из льтуры выросшей при температуре4 С10 1703681 Продолжение табл 3 алца а кСЧПОенть к г,т 1 лк еа.чикекстрлн стоак Н РОл 21 Нлг:гРО 4всма Та а бл б тво иза КГА 4 12 19 Составитель Г УсановТехред М.Моргентал Релакто Волкова ктор Т. Мале аказ 40 ВНИИПИ Гос Тираж ственного ком 113035, МосГКНТ СС Производственно-издательский комбинат "Патент город, ул.Гагарина,020,0 с 1020 02 О 20 0 2 мпература выращи, ния накопительнойкультуры. С 17 11 12 15 в Количество изолятов, идентифицированн Подписноетета по изобретениям и открытиямва, Ж. Раушская наб 4/5