Способ получения l-пролина

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН Р 3/24//(СК 1; 13) 51) 4 С 13 2 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ ЕТЕЛ Н АВТОРСНО и ст СУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(71) Научно-исследовательский технологический институт аминокислот(54) (57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Ь-ПРОЛИНА путем ферментации с использованиеммутантов микроорганизмов, относящихсяк роду ВгечЬасегжш в питательной. среде, содержащей усвояемые источникиуглерода, азота, неорганические солиимуляторы роста с последующим выделением целевого продукта, о т л и - ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения выхода Ь-пролина, используют мутанты ВгечЬасегйлп Е 1 ачцш, устойчивые одновременно к.аналогам пролина и к повышенному осмотическому давлению среды и неспособные, катализировать Ь-пролин.2. Способ по п. 1, о т л и ч аю щ и й с я тем, что в качестве мутантов используют штаммы бактерий ВгечхЬасгегжш Е 1 ачцш АР 111 или Вгеч 3.Ьасгегцш Е 1 ачцш АР 112.3. Способ по п. 1, о т л и ч а - ю щ и й с я тем, что в качестве му . тантов используют штаммы бактерий а ВгечдЬасгегыш Е 1 ачиш,АР 110 или Вгечз.Ьасгегз.цш Е 1 ачцш АР 113.С:Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения 1.-пролина при помощи ферентации с использованием мутантовикроорганизмов, продуцнрующих Е-пролин, что является одной из важнейих аминокислот, и используется ведицине.Цель изобретения - повышение вы хода с 1.-пролина,Цель достигается путем использоваия мутантов ВгечЬасСегшш Г 1 ачпш устойчивых одновременно к 3,4-дегидро-Р,Е-пролину (далее именуется ДП) 15 и повышенному осмотическому давлению среды и неспособных катаболизировать-пролин. Причем, мутации сообщающие бактериям устойчивость к ДП и повы - енному осмотическому давлению среды 20мутации, сообщающие бактериям неспособность катаболизировать 1,-проин, как и комбинации этих мутаций ,обладают положительным эффектом в отношении увеличения уровня выхода 1,- 25 пролина также в сочетании с иными мутациями, способствующими прЬдукции-пролина, например мутациями ауксотрофности по 1 -изолейцину. Примерами штаммов - продуцентов Е-пролина, использованных в предлагаемом изобретении и хранящихся в Центральном музее промышленных микроорганиэттов института "ВНИИгенетика" под соответствующими номерами ЦМПМ В, являются следующие мутанты ВгетЬассегз.цта Г 1 ачцш штамм АР 111 (ЦМПМ В),штамм АР 110 (ЦМПМ В) штамм АР 112 (ЦМПМ В) и штамм 40 АР 113 (ЦМПМ В), Указанные новые ытаммы получены генетико-селекционными приемами из штамма Вгеч.Ьасгеггцтн К 1 ачцш ЛТСС 14067, Штаммы АР 111 и АР 112 являются мутантами: устойчивыми одновременно к ДП и повышенному осмотическому давлению среды, а штаммы АР 110 и АТ 113 - мутанты, устойчивые одновременно к ДП и повышенному осмотическому давлению и неспособные катаболизировать 1,-пролин. Кроме того, штаммы АР 111, АР 112 и АР 113 являются также мутантами, нуждающимися в 1,-изолейцине для роста. Штаммы АР 110, АР 111 и АР 112 и АР 113 сходны,55 за исключением перечисленных признаков и пролинпродуцирующей способности, по своим культурально-морфологическим, культуральным и физиологическим признакам со штаммом Вгеч 1 Ьассегтцш т 1 ачцтн АТСС 14067.Мутации устойчивости к ДП и повышенному осмотическому давлению среды, неспособности катаболизироватьЕ-пролин и ауксотрофности по Ь-изолейцину могут быть получены поэтапно и в тдобом порядке с помощью мутагенизации бактерий любым известнымспособом (например, обработкой 11-метил-М -нитро-И-нитрозогуанидином илиультрафиолетовым облучением) на каждом этапе и последующей идентификацией соответствующих мутантов, Указанные мутации могут быть также получены у разных штаммов и совмещены водном геноме с использованием какоголибо способа генетического обмена,например, слияния протопластов, В качестве соединений повышающих осмотическое давление среды могут быть использованы сахароза или хлорнды щелочных металлов, например, хлориднатрия.Штаммы-продуценты Е-пролина, использованные в предлагаемом изобретенииполучают следующим образом,Получение штамма ВгечЬасегтцтпЕ 1 аъцтп АР 110.Штамм Вгеут.Ьасгегцтн й 1 ачинт АТСС 14067 выращивают в мясо-пептонном бульоне (далее МПБ) при 30 С с аэрацйей до достижения титра 10 клеток/мл, Клетки отмывают от МПБ центрифугированием, промывают цитратным буфером, рН 5,6, вновь осаждают центрифугированием и ресуспендируют в цитратном буфере, рН 5,5. К полученной суспензии добавляют И-метил-Я-нитро-И-нитрозогуанидин (далее НГ) до конечной концентрации 300 мкг/мл и инкубируюто с аэрацией в течение 20 мин при 30 С. Затем клетки отмывают от мутагена охлажденным МПБ, переносят в пробирки с 10 мл МПБ и инкубируют 18 ч с .аэрацией при 30 С, Полученную мутагенизированную НГ культуру осаждают центрифугированием и переносят в пробирки с,о средой Р 1 состава, мг/мл; сахароза 250; МаВО 2; К НРО 3;КН РОА 1; МяБО 7 НО 01; ННС 1 5; ИН+Ю 1; МпБО, 5 НО 1 10 ; РеБО х ;х 7 Н 0 1 10; биотин 210; тиамина хлорид 10" ф и ДП 1,5, рН 7,4 с таким расчетом, чтобы начальный титр культуры был равен 10 клеток/мл.Культуру в пробирках выращивают соаэрацией при 30 С до помутнения (48 140965972 ч), затем рассеивают на поверхности среды Р 1, содержащей 27. агар-агара и инкубируют 48 ч при 30 С, Одиниз выросших на этой среде мутантоввновь подвергают мутагенезу НГ какэто описано и высеивают на поверхность агаризованной среды У 2 состава, мг/мл: глюкоза 20; Ма БО 2;3; ЕН РО, 1; ИН,С 1 3; МН О,1; ИфО 7 НО 0,1; МпБО 5 Н,О1 О ф,Ре 804 к 7 Н,О 1 1 О ; биотин 5 10 ; тиаминахлорид 1 10 и агар-агар 20; рН7,4. Отдельные колонии, выросшие наэтой среде через 48 ч инкубации при30 С, проверяют на способность к,росту на среде У 3, которая содержитЬ-пролин в качестве единственного источника углерода и азота для роста,состав среды Н 3, мг/мл: Ь-пролин10; БаКО 2; ЕНРО 3; ЕН РО 1;М 88047 НО О, 1; Мп 804 5 Н О 1 О80 ф 7 Н О1 О 4 биотин 5О ф гиамина хлорид 1 10 .и агар-агар 20,рН 7,4, Колонии, неспособные к ростуна среде3 через 96 ч инкубации .прио30 С, проверяют на пролинпродуцирующую способность в условиях, указанных в примере 1, Один из отобранныхтаким образом мутантов обозначен ВгечдЬасгеглпп Г 1 ачцш АР 110,Получение штамма ВгечгЬасгег 1 цшГ 1 апип АР 111.Мутагенизированную культуру штаммаА СС 14067 (условия мутагенеза такиеже, как выше при получении штаммаАР 110) высевают на среду Р 2, котораясодержит дополнительно Ь-изолейцин вконцентрации 0,5 мг/мл, Среди колоний, выросших на этой среде через48 ч инкубации при 30 С отбирают мутант, неспособный к росту на средеВ 2, которая не содержит Ь-изолейцин.Полученный изолейциновый ауксотрофвновь мутагенизировали Н 7 и отбираютмутанты, устойчивые к ДП и повышенному осмотическому давлению среды, какописано при получении, штамма АР 110,но с той разницей что в среду У 1вносят вместо 250 мг/мл сахарозы20 мг/мл глюкозы и 28 мг/мл ИаС 2, атакже 0,5 мг/мл Ь-изолейцина. Одиниз отобранных таким образом мутантов,продуцирующий повышенные количестваЬ-пролина, обозначен ВгечЬасгегхцшГ 1 ачцш АР 111,Получение штамма ВгечЬасег 1.цшЕ 1 ачцш АР 112.Изолешцновый ауксотроф штамма АТСС14067,индуцированный НГ, как описанопри получении штамма ЛР 111,вновь обрабатывают НГ и отбирают мутанты, устойчивые к ДП и повышенной концентрациисахарозы на среде Ф 1, как описано,для получения штамма АР 110 с той разницей,что среда В 1 содержит 0,5 мг/млЬ-изолейцина. Один из отобранных таким образом мутантов, продуцирующийповышенные количества Ь-пролина, обозначен ВгечЬасег 1.цш Г 1 ачцш АР 112.Получение штамма ВгечдЪасгег 1.цшГ 1 ачцш АР 113,У штамма АТСС 14067 отбирают мутант, неспособный катаболиэироватьЬ-пролин с помощью приемов, описанных при получении штамма АР 110. Наследующем этапе у полученного штамма,неспособного катаболизировать Ь-пролин, отбирают мутант, устойчивый кДП и повышенной концентрации сахаро 10 15 20 го двойного мутанта, который неспособен катаболизировать Ь-пролин и устойчив к ДП и повышенному осмотическому давлению среды, отбирают мутант,нуждающийся в Ь-изолейцине для роста, приемами, описанными при получении штамма АР 111, Один из полученных таким образом мутантов, продуцирующий повышенные количества Ь-пролина, обозн;,чен Вгеч 1.Ьасгегдцш г 1.ачцш АР 113.Отличительные признаки мутантных штаммов, использованных в предлагае 1 мом изобретении, в сравнении друг с 30 35 другом и штаммом АТСС 14067 даны втабл. 1,Способность к катаболизму Ь-пролина определяют по появлению роста взоне нанесения капель суспензий штаммов, указанных в табл. 1, на поверхности агаризованной среды У 3 (составсреды Р 3 указан) после 96 ч инкуба.,ции при 30 С. Появление роста обозначено знаком "+", а отсутствие ростазнаком 40 45 Для определения устойчивости к ДП и повышенному осмотическому давлению среды бактерий штаммов, укаэанных в табл. 1, вносят из расчета 10 кле 5 ток/мл в пробирки с жидкой средой У 1 (состав среды 9 1 указан), содержащей 250 мг/мп сахарозы и различные концентрации ДП (в случае штаммов АР 111, АР 112 и АР 113 среда В 1 содержит Ь-изолейцин в концентрации 50 55 зы, с помощью приемов, описанных для25 получения штамма АР 110, У полученно1409659 т с р о р т т 3 ч ц Ь д р ( м в д Таблица 1 Штамм Вгеч 1 Ьасгегипп Г 1 ачцв Относительный рост, % Способность к Концентрация ДП, мг/мл ростуна среде спролином как 2,0 00,75 1,0 источником углерода иазота 100 13 12 12 8 100 76 67 53 46 АТСС 14067(АР 110 (ЦМПМ В) 5 мг/мл). Пробирки инкубнруют в тение 24 ч при 30 С с аэрацией, а заи определяют оптическую плотность льтур при 540 мкм. Представленные табл. 1 данные выражены в проценх от оптической плотности культур, ащенных в среде У 1, которая не держала ДП.Для накопления Ь-пролина в культуьной жидкости мутантов, предлагаев данном изобретении, могут быть пользованы любые питательные среды, держащие усвояемые источники угледа, азота, неорганические соли и ганические вещества, стимулирующие ст микроорганизмов и продукцию нролина.Накопление Ь-пролина имеет место и культивировании в аэробных усяоях в достаточно широком диапазоне мператур и значений рН, хотя опмальными являются температуры 28- С, а значения рН 6,5-8,5.Появление Ь-пролина наблюдается рез 8-10 ч после начала Фермента- и. Однако, максимальный уровень пролина в культуральной жидкости стигается в результате полного потбления источника углерода и энергии ерез 36 ч и более после начала Фернтации в зависимости от использонной концентрации источника углерои энергии).Содержание Ь-пролина в культуральй жидкости определяют с помощью меда бумажной хроматографии и окрашиния иэатином.Накопленный Ь-пролин может быть щелен из культуральной жидкости любым известным способом, таким какудаление бактерий и нерастворимыхчастиц проточным центрифугированиемили Фильтрацией, посадка Ь-пролинана ионообменные смолы с последующимиэлюцией, концентрированием и кристаллизацией Ь-пролина.П р и м е р 1, В ферментационные10 колбы объемом 250 мл асептически разливают по 10 мл простерилизованнойферментационной среды следующего состава, г/л: сахароза 150; (МН)КО55; КНРОд 1; МАМБО, 7 Н 0 10; СаСОЗ15 50; РеБО 7 Н 0 0,0 1; МпЯО+ 5 Н 0ф п 80 7 Н О О 01 биотин 0 0005тиамина хлорид 0,0005; рН 8,0. Колбыинокулируют штаммом Вгеч 1 Ьассег 1 цвГ 1 анцв АР 110 и инкубируют на качалке20 в течение 72 ч при 30 С, В полученной после инкубации культуральнойжидкости выход Ь-пролина составляет40,5 г/л, В этих же условиях штаммВгеч 1 Ьассеггцщ Е 1 ачцв АТСС 14067 про 25 дуцировал 3,4 г/л Ь-пролина,П р и м е р 2, Условия ферментации и состав ферментационной среды,как указано в примере 1, с тем исключением, что в состав среды вносят так 30 же Ь-изолейцин в концентрации 0,15 г/ли различные колбы инокулируют штаммами Вгеч 1 Ьас 1 еггцв Й 1 ачцв АР 111, ВгечгЬасСеггцщ Г 1 ачцв АР 112 и Вгеч 1 Ьас -г.егдцщ К 1 ачцщ АР 113, Выход Ь-пролинав культуральных жидкостях, полученныхпосле Ферментации указан в табл. 2,В аналогичных условиях выход Ь -пролина у изолейциновых ауксотрофовштамма ВгечгЬасеггцв 11 ачцв АТСС14067 не превышает 20 г/л., 1,-проли 113 Составитель Н. АфанасьевТехред Л.Олийнык тор В.Гирняк о гляни Тираж 520 сно ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5 оизводственно-полиграфическое предп Штамм Вт йегпш Н Редактор ИЗаказ 3446 ость осту а сре ом ка сточамм Вгеч 1 Ьасег 1 цщ Й 1 ачив