Способ количественного определения фосфолипидов

(5 01 М 21 7 НИЯ В СВИДЕТЕЛ К АВТОР ность. Врем разца 5 мин образцов 8 в 2,5 раза при высокой чем в извес 6 табл. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРпО делАм изОБРетений и ОтнРытии ОПИСАНИЕ И(54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОСФОЛИПИДОВ(57) Изобретение касается аналитической химии, в частности количественного определения фосфолипидов в липидных экстрактах, полученных из различных видов тканей, клеток, субклеточных Фракций и биологических жидкостей. Цель изобретения - повышение чувствительности и селективности ана лиза, Последний ведут обработкой про бы в растворителе - СНС 1 с помощью3красителя - раствора основного синег К в глицерине и/или этиленгликоле. Целесообразно после обработки красителем в полученную смесь добавлять этиленгликоль. Затем отделяют экстракт и измеряют его оптическую плотределения одного обремя измерения 5-ти мин, Способ обеспечивает учшую чувствительность селективности анализа, ном случае. 1 з,п, злы,45 1 13433Изобретение относится к областианалитической химии, а именно к способам колориметрического определенияколичества фосфолипидов в липидных5экстрактах, полученных иэ различных. видов тканей, клеток, субклеточныхфракций и биологических жидкостей,Целью изобретения является повышение селективности и чувствительностианализа11 р и м е р . В пять стандартныхпробирок вносят по 6 мкл растворафосфатидилэтаноламина (ФЭА) в хлороформе (16,7 мкг/мкл), по 3 мл хлороформа и по 0,5 мл раствора красителяосновного синего К в глицерине (4 мг//60 мл). В контрольные пробирки фосфолипид ве вносят, Смесь тщательновстряхивают несколько раз, добавляютпо 1 мл этиленгликоля в каждую пробирку и опять перемешивают встряхиванием. Через 3 мин (после расслоенияфаз) отбирают гастеровской пипеткойпо 2,5 мл окрашеннои хлороформнои фазы и измеряют ее оптическую плотность(011) при 590 нм на цифровом спектрофатометре в 1-сантиметровой кюветепротив контроля, Оптическую плотностьхлороформной фазы в контрольных пробир ах измеряют против хлороформа,Результаты измерений: ОП контролей0,138 и 0,147 ед, ОП,Результаты определения оптическихплотчостей в присутствии красителя35в 100 Е-ном глицерине приведены втабл,1,Время определения одного образца5 мин, время измерения пяти образцов - 8 мин. Основной недос.аток определения - высокая вязкость глицеринового раствора красителя, что затрудняет его дозировку при введении,П р и м е р 2, Способ осуществляется как в примере 1, но красительрастворяют в 1007-ном этиленгликоле(4 мг/60 мл), Оптическую плотностьконтрольных и опытных образцов измеряют против хлороформа, Результатыизмерений приведены в табл, 2Бремя определения одного образна20-25 мин, время измерения пяти об разцов - 30 мин, Чувствительностьметода, как в примере 1.Медленное отделение избытка красителя из хлороформной фазы, диффузнаяграница раздела фаэ, снижение точности измерений, увеличение разброса.результатов измерения, высокий контроль сужает диапазон определяемых количеств фосфолипидов.П р и м е р 3, Без проведения отмывки избытка красителя этиленгликолем перед колориметрией образцов.Способ осуществляют согласно примеру 1, но краситель растворяют всмеси глицерин/этиленгликоль 1: 1 об//об (4 мг/60 мл), Оптическую плотность образцов измеряют против хлороформа. Результаты измерений приведены в табл,3.Время определения одного образца15 мин, время измерения пяти образцов - 18 мин, Чувствительность метода, как в примере 1Интенсивная окраска контроля, нечеткое разделение фаз и избыток красителя в хлороформной фазе существенно снижают воспроизводимость измерений,П р и м е р 4, Подбор оптимальногоминимального объема этиленгликолядля отмывки избытка красителя передколориметрией образцов,Способ осуществляют согласно примеру 3. Перед колориметрией хлороформную фазу промывают 0,2-5,0 мп этиленгликоля, При этом пропорциональноувеличению добавляемого объема этиленгликоля происходит уменьшение объема хлороформа и повышение скоростиперехода избытка краски из хлороформной фазы. Результаты измеренийприведены в табл,4.Таким образом, оптимальный минимальный объем этиленгликоля составляет 1,0 мл, а измерения можно проводить в интервале объемов этиленгликоля 0,2-3,0 мп, т,епри объемномсоотношении этиленгликоль;хлороформный раствор фосфолипида (0,2-3,0)::3,0П р и м е р 5. Избирательное количественное определение фосфолипидовв бинарных смесях на примере смесиФЭА с фосфатидилхолином (ФХ).Смесь фосфолипидов: 6 мкл ФЭА/мкл) вносят в три пробирки, В трипробирки вносят ФЭА беэ ФХ и две пробирки без фосфолипидов служат контролем, Определение количеств фосфолипидов проводят, как в примере 3, с отмывкой красителя 1,0 мл этиленгликоляОбраз ец ОП 0,6230,6100,632 0,621 0,6200,625 3,54 Таблица 2 онтроль 1 0,670,695 онтроль 2 О, 72 1 1,29 0,60 1,330 0,635 1,302 0,607 0,61 7,4 оде 1, 282 Таблица 3 оответству ипиды доба а и метано ср эффен бра О ыи Предлагаемо определени пособ количестве сфолипидов по ср нов -4 ыварианию с изв ние чувст троль 1 0,426 овышение сел 0,4 онтроль 2 0,4 м у л э о б р е т е н 07 1,62 ия ф О, 968 рас фор,619 57,925 0,47 100 0,65 279 0,82 ением птице Йия селе чувствит 3 13433Таким образом, предлагаемый методне позволяет опредечять ФХ, что может быть использовано для прямого(без тонкослойной хроматографии) оп 5рецеления количествдругих фосфолипидов, входящих в состав бинарных смесей с ФХ,П р и м е р 6, Определение ФЭА вприсутствии метанола10В десять опытных пробирок вносятпо 6 мкл раствора ФЭА в хлороформе(16,7 мкг/мл) и в каждую пару пробирок добавляют различные количестваметанола (О, 20, 50, 100 и 150 мкл),В десять контрольных пробирок (бездобавления Фосфолипидов) добавляютпопарно по О, 20, 50, 100 и 150 мклметанола,Затем по все пробирки добавляютпо 3 мл хлороформа, смесь встряхивают, добавляют во все пробирки по0,5 мп красителя - основного синегоК (4 мг/60 мл) из раствора этиленгликоль - глицерин (1:1) и после тщательного перемешивания в каждую пробирку добавляют по 1 мп этиленгликоля.Смесь в пробирках тщательно перемешивают и после расслоения Фаз отбирают нижнюю (хлороформную фазу) пастеровской пипеткой. Далее измеряютОП образцов на спектрофотометре при590 нм против чистого хлороформа иливоды в 1-сантиметровых кюветах, Результаты измерений представлены втабл,6,35Поскольку основной средой для определения фосфолипидов является хлроформ, то добавление в среду опрления аликвот метанола полност тому, как если бы Фосфоялись из смеси хлорофор тным обеспечивает по тельности в 2,5 раза ективности определен особ количественного опред сфолипидов путем обработки анализируемой пробы в хло асителем с последующим отд кстракта и измерением его ой ппотности, о т л и ч а я тем, что, с целью повыше ктивности определения и его ельности в качестве красит ля используют раствор основного синего К в глицерине, или этиленгликоле, или в смеси глицерина с этиленгликолем.2, Способ по п1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что после обработки пробы красителем в полученную смесь добавляют этиленгликоль.Таблица 11343319 ВремярасслоеОстаточный объем хлороформной фазы после расслоения фаз, мл ДобавленоэтиленОбразец ОПср ОП гликоля,нияфаз,мин 15 0,453 15 1,088 12 0,426 12 1, 027 5 0,300 5 0,950 3 0,170 3 0,795 3,0 1 Контроль 0,635 3,0 Опыт 2,8 0,2 Контроль 0,601 2,8 0,2 Опыт 2,6 0,5 Контроль 0,650 0,5 2,6 Опыт 2,4 1,0 Контроль 0,625 2,4 1,0 Опыт 2,5 2,0 2,0 Контроль 2,5 2,0 2,0 Опыт 2,0 3,0 1,5 Контроль6 2,0 3,0 1,5 Опыт 1,5 0,5 5,0 Контроль 0,5 5,0 1,5 Опыт Коэффициентвариации,7 ОП ОП Образец 0,150 Нет Контроль 1 Контроль 2 0,6330,627 0,625 2,88 ФЭА 0,6150,602О, 615 О, 619 ФЭА + ФХ 6,1 0 790 0 640 Фосфолипиды О, 154 0,147 0,783 0,777 0,765 0,752 0,765 6Таблица 4 Объем остающейся хлороформной фазы ниже требующегося для измерений в обычныхкюветах Т а б л и ц а 5(опыт "контроль) Коэффициент ОП Опыт Контроль го метаиола,мклЗаказ 4817/45 Тираж 776 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб д, 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул, Проектная, 4 7 100 8 100 9 150 10 150 Объем оставшейсяхлороформной фазы,Объем оставшейся хлороформной фазыне позволяет надежно проводить измерения ОП в обычных кюветах, так какон ниже нижнего предела