Способ электрохимического определения глюкозы и электрод для его осуществления

(5 Ц 4 С 01 И 27/42 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ла Фермент в анализир (рН ( 7,5 после чего лект д выдерживаюторе при 7,01,5-12 мин,оличество элект емом рас в течени змеряют ричества, пропнию глюкозы,2. Электрого определениятокопроводящии рциональное содержа для глю электрохиь озы, содер ическ жащий ныл с с тнедине токоотводом и л и ч а ю щ и повышения чув ния, электрод слоем сажевой фермй с п слои что,сти оптеь с целью ределенабжен ным межьн в дополнительно пасты, размещ токопровод им и ферментным слояпо п.2, о т л и ч а ючто токопроводящийз комплекса И-метилрацианохинодимет Элек тродйс ятем,слои выполнен и феназиния и тет аГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬГГИЙ(71) Институт биохимии АН ЛитССР(54) СПОСОБ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ И ЭЛЕКТРОД ДЛЯ ЕГООСУЩЕСТВЛЕНИЯ.(57) 1. Способ электрохимическогоопределения глюкозы, заключающийсяв наложении потенциала на ф ерментныйэлектрод, о т л и ч а ю п 1 и й с я .тем, что, с целью повышения чувствительности,перед наложением потенциаЯОИ 80771180771 Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано в медицине для определения концентрации глюкозы.Цель изобретения - увеличение 5 чувствительности способа.П р и м е р 1. Определение глю.козы на электроде, модифицированном сажей.Стеклоуглеродный электрод с раба чей поверхностью 0,1 см получают путем нанесения на его поверхность 1 мг пасты из сажи марки ПМи воды (1:2 по весу). Затем на элект" род наносят 10 мкл раствора глюко зооксидазы (60 мкМ), наверх надевают диализную мембрану и закрепляют ее резиновым кольцом, Далее электрод погружают в 0,1 М фосфатный буфер рН 7,0 в электролизной ячейке 2 О и задают ему потенциал 0,0 В относительно А/АрС 1 электрода сравнения. После 10 мин вводят 10 или 20 мкМ глюкозы и проводят накопление в течение 1,5-8 мин. По истечении этого времени биполярным ключом включают потенциал 0,4 В и определяют количество накопленного электричества в течение 10 с.В табл. 1 приведены данные зависи-.ЗО мости накопленного электричества от времени накопления при определении глюкозы (рН 7,0, 0,1 М фосфатный буфер). Таблица 2 Концентрация глюкозы, мкМ 20 2,2 5,2 Таблица 40 10,4 Количество электричества,мкКл, при концентрацииглюкозы, мкМ 40 Время накоплениямин 60 15,4 80 10 20 100 22,5 122 24,5 120 25,0 180 25,5 20 30 Из табл. 2 видно, что при времени накопления 1,5 или 4 мин графикопределения глюкозы линеен до 110 у и 70 мкМ соответственно. Нижний предел определения метаболита составля-.ет 20 мкМ. Электрод сохраняет работоспособность 5 дн. П р и м е р 2. Определение глюкозы на электроде, модифицированном редокс полимером.Стеклоуглеродный электрод с рабочей поверхностью 0,1 см модифицируют путем ацсорбции из 0,27-ного водного раствора редокс полимера - поливинилпиримидина, кватернизованного 2-бромбензохиноном в течение 5 мин. Затем электрод промывают водой, на его поверхность наносят 10 мкл раствора глюкозооксидазы (60 мкМ), наверх надевают диализную мембрану, которую закрепляют резиновым кольцом. Электрод погружают в 0,1 М фосфатный буфер (рН 7,0) в электролизной ячейке и задают потенциал 0,03 В относительно Ад/А 8 С 1 электроца сравнения, После 10 мин вводят 20-200 мМ (интервал концентраций для построения калибровочного графика) глюкозы и проводят накопление в течение 1,5 или 4 мин. По истечении этого времени биполярным ключом 2 включают потенциал 0,4 В и определяют количество накопленного электричества в течение 30 с.Данные определения глюкозы (рН 7,0; 0,1 М фосфатный буферный раствор) приведены в табл. 2. Количество электричества, мкКл, при времени накопления, мин,2 5 8,1 7,0 1,7 0 9 10,8 20 п едел П р и м е р 3. Определение накопления электричества глюкозы в зависимости от времени и степени модификации электрода редокс полимером.Стеклоуглеродный электрод с рабо чей поверхностью 0,1 см модифицируют путем адсорбции из 0,27-ного этапольного раствора полигидрохлорида в течение 2 или 5 мин. Затем электрод промывают этанолом и водой, по Р гружают в 0,1 М фосфатный буфер(рН 7,0) и путем записи циклической вольтамперограммы определяют степень модификации электрода редокс группами, составляющую 0,3 и 0,5 нмоль см15 соответственно. Затем на поверхность электрода наносят 10 мкл раствора глюкоэооксидазы (60 мкМ), покрывают диализной мембраной, которую закрепляют резиновым кольцом, Электроду 20 задают потенциал 0,0 В относительно А 8/АдС 1 электрода сравнения, После 10 мин вводят 80 мкМ глюкозы и проводят накопление в течение 1,5; 3; 5;8; 12 мин. По истечении этого време ни биполярным кольцом 2 включают потенциал 0,4 В и определяют количество накопленного электричества в течение 30 с.Данные зависимости количества на- Зр копленного электричества глюкозы от времени и степени модификации электрода (концентрация глюкозы80 мкМ в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,0, й 25 С) приведены в табл. 3. Количество электричества, мкКл, при степени моди р Аикации, нмольсм иведенных данных видно, чтоая величина накопленного электричества достигается при времени накопления более 12 мин. Количество накопленного электричества увеличивается с увеличением степени модификации электрода редокс полимером.П р и м е р 4, Определение глюкозы на электроде из токопроводящего органического комплекса. Электрод, полученный путем прессования токопроводящего комплекса тетрациано-и-хинодиметана и М-метилфеназиния, с рабочей поверхностью 0,3 см, содержащий под диалиэной мембраной 1 О мкм раствора глюкозоок" сидазы (60 мкМ), погружают в 0,1 М фосфатный буфер (рН 7,0) в электролизной ячейке. Электроду задают потенциал 0,3 В относительно Ад/АдС 1 электрода сравнения и выдерживают 10 мин. После этого вводят 10- 200 мкМ (интервал концентраций для построения калибровочного графика) глюкозы и проводят накопление в течение 5-10 мин. По истечении этого времени биполярным ключом включают потенциал 0,0 В и в течение 60 с определяют количество накоплен,ного электричества. Данные зависимости накопленного электричества при определении глюкозы (рН 7,0; 0,1 М фосфатный буфер) приведены в табл. 4.1180771 Продолжение табл. 4 во накопленногоества,мкКл,принакопления, мин аблиц Количесричествпри врекопления 10 онцентрация лаката, мкМ, приремени накоплево электмкКл, ени на 49 ния, м м Из приволичествоа с исполь 5 5 0 2 0,18 комплексов ву глюкозыНижний предсоставляет 0,032 г,0,0). Злектсть в те пл 40 Определение ла ата (рН 7,0аствор. денных данных видно, чтонакопленного электричестзованием токопроводящихпропорционально количести времени накопления,ел определения метаболит0 мкМ Приме р 5козы в крови.Исследования проводят аналогично примеру 4 эа исключением введения 0,1 мл десятикратно разбавленной буферным раствором крови человека вмес то раствора глюкозы в электрохимичес кую ячейку объемом 5 мл. При времени накопления 10 мин количество накопленного электричества составляет 2,35 мкКл, Концентрация глюкозы в крови, рассчитанная на основе калибровочного графика, составляет (с учетом разбавлений) 5,1 мМ (91,9 мг.7) что близко физиологическому уровню метаболита (80-100 мг Е).П р и м е р 6. Определение концентрации лактата.Графитовый электрод с рабочейощадью электрода 0,15 см 2 погружают в 9,2 мкМ раствора цитохрома В в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,0) в течение 2 ч. Потом электрод отмывают тем же буфером и погружают в 2 мл буферного раствора в электролизной ячейке. На электрод задают потенциал величиной 0,2 В относитель но А 8/А 8 С 1 электрода сравнения.После 10 мин вводят 10 мкл 0,004-.0,2 мМ Ь-лактата (интервал концентрации для построения калибровочного графика) и проводят накопление в те" чение 5 ипи 20 мин. По истечении это го времени биполярным ключом 2 включают потенциал 0,2 В и определяют количество накопленного электричества в течение 2 с.Данные определения лакт0,1 М Фосфатный буферный р 25 С) приведены в табл. 5. Из приведенных данных строится калибровочный график зависимости количества 5 накопленного электричества от концентрации Ь-лактата в ячейке. Калибровочный график опрлактата линеен до 0,16 и О,при 5 и 20 мин накопления.предел определения метаболитляет 0,020 (5 мин накоплени0,032 мкМ (20 мин накоплениярод сохраняет работоспособнтечение 7 дн.Пр имер 7 тата в слюне.Аналогично примеру 6 за исключением введения 10 мкл десятикратноразбавленной буферным раствором 4 слюны вместо раствора лактата. Привремени накопления 20 мин количество накопленного электричества состав"ляет 5,9; 6,4 и 7,5 мкКл для разныхобразцов. Концентрация молочной, кислоты в слюне, рассчитанная на основе калибровочного графика, составляет 0,59; 0,64 и 0,76 мМ, что близко физиологическому уровню метаболита (7,4 мг 7. по известным данным).55 Н р и м е р 8. Определение концентрации Н ОНа поверхность графитовогоэлектрода, импрегнированного парафиЗаказ 5913/41 Тираж 896 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 ном (0,018 см) наносят 10 мкл раствора пероксидазы растительного происхождения (10 мкМ) в 0,1 М фосфатцитратном буфере (рН 5,2). Раствор фиксируют на поверхности при помощи диализной мембраны, закрепляемой на корпусе электрода резиновым кольцом. Электрод погружают в электрохимическую ячейку, содержащую 25 мл 01 М фосфат-цитратного буфера, рН 5,2,25 С, задают потенциал 0,4 В относительно Ад/А 8 С 1 электрода сравнения.и выдерживают при нем 10 мин. После этого в ячейку вводят 0,2 мл 0,63-3,78 мМ (интервал концентраций для построения калибровочного графика) раствор перекиси водорода в том же буферном растворе и проводят накопление электричества в течение 1 или 2 мин (в реакционной смеси из-за разбавления концентрации НО 2 составляет 5-30 мкМ).По истечении времени накопления биполярным ключом включают потенциал 0,0 В и определяют количество накопленного электричества в течение 2 с с задержкой начала измерения 120 мс,Данные определения Н 202 (рН 5,2;0,1 М фосфат-цитратный буферный раст вор, й 25 фС) приведены в табл, 6 Из приведенных данных видно, что25 при времени накопления 1 или 2 минкалибровочные графики определенияперекиси водорода линейны до 30 мкМ,Нижний предел определения НО ГмкМ.Электрод сохраняет работоспособностьов течение месяца при 4 С.