Способ определения транспорта ионов калия грамотрицательными бактериями

ОП ИСАНИЕИЗОВРЕТЕН ИЯИ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ оц 92752 Союз СоветсиииСоцнвлистичвсиниресттубттии(23) Приоритет С 12 К 1/00 Ьвударстееинм 6 квинтет СССР ао делам изабретеиий и еткритиВ.2(088.8) Дата опубликования описания 15 . 03 . 82(71) Заявител ныи научно-исследовательский институ микробиологии сесо 4) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЯ ТРАНСПОРТА ИОНОВ КАЛИЯЛЬНЫМИ БАКТЕРИЯМИ . онов к светорассея Способ о разом,Гомогенную суспензию отмытыхдистиллированной воде бактерий вцентрации 10 -10 кл/мл помещают в8оптическую кювету, содержащую раствор сахарозы или маннита (250-500 мИЧерез 1-2 мин регистрируют изменениясветорассеяния суспензии бактерий пр, свете с длиной волны 500-600 нм. Затем в кювету вносят хлористый калийдо конечной концентрации О, 1- 10 мИи регистрируют уменьшение светорассеяния во времени, Динамика изменений светорассеяния при этом однозначно отражает накопление бактериямиионов калия. Измерения изменений светорассеяния бактериальной суспензии 20проводят на флуориметре, спектрофо"тометре или фотоэлектрокалориметрепо точкам или с использованием регистрирующего самописца,в конЦелью ение тоУказа то сусп ор саха ации 25 ор хлор ,0- 10,0. Изобретение относится к медицине, в частности к микробиологии, и может быть использовано для оценки физиологического состояния грамотрица" тельных бактерий в микробиологичес-. кой промышленности, а также в биохимических, микробиологических и биоФизических исследованиях.Известен способ, определения транспорта ионов калия грамотрицательными бактериями с использованием ионоселективных электродов 1.Однако известный способ не позволяет точно определить транспорт ионов калия. изобретения является повы-,ности способа.ная цель достигается тем,нзию бактерий вносят в растозы или маннита в концентмМ, затем вводят растда калия в концентрациимМ, и определяют транспорт регистрацией измененияия суспензии во времени.уществляют следующим об9127523На чертеже показана зависимостьинтенсивности светорассеяния суспензии бактерий от времени.П р и м е р 1. Эксперимент проводится на Езйег 1 спа СоИ и Рзецдо-аопаз аегцд 1 поза.Результаты, полученные на обоихпредставителях грамотрицательных бактерий, одинаковы,В оптическую кювету помещают раствор 250 мМ сахарозы, к которому до"бавляют дважды отмытые в дистиллированной воде и ресуспендированные вводе до гомогенности клетки бактерийдо конечной концентрации 510 кл/мл.,15Кювету помещают в флуориметр и реги"трируют светорассеяние при 600 нмпод углом 90 О. К суспензии добавляют хлористый калий до конечной концентрации 10 мМ, перемешивают в течение 3-5 с и регистрируют уменьшениесветорассеяния клеточной суспензииво времени, На чертеже показан характер получаемой зависимости светорассеяния от времени (стрелкой показан 5момент добавки КСВ). Зарегистрированное уменьшение светорассеяния суспензии бактерий в указанных условияходнозначно отражает энергозависимоенакопление ионов калия клетками. Ионынатрия до концентрации 50 мМ не сказываются на регистрируемой реакции,Тождественные результаты получают.ся при регистрации изменений оптической плотности суспензии.бактерий.П р и м е р 2, Берут бактерии35Е.СоИ, дважды отмытые в дистиллированной воде, и готЬвят из них гомогенную водную суспензию с концентрацией клеток 10 кл/мл. Суспензию деДлят на три порции.: две опытных и од-ну контрольную. Первую опытнуЮ пробуобъемом 0,5 мл замораживают в стеклянной пробирке до - 19 ФС путем быстрого погружения пробирки в жидкийазот, где ее выдерживают 5-10 мин.45После этого пробирку вынимают из жидкого азота и размораживают при комнатной температуре. Вторую опытнуюпробу объемом 0,5 мл замораживают до- 78 фС на сухом льду и лиофилизируют, фвПосле лиофилизации регидратируютдобавкой 0,5 мл дистиллированной воды. Контрольный образец хранится всевремя при кЬмнатной температуре безкаких-либо обработок, Во всех трех об" ффразцах регистрируют калий-транспорти.рующую активность предлагаемым способом. фВ табл. 1 представлено изменение параметров калий - транспортирующей активности бактерий Е. Со после ниэкотемпературного замораживания и лиофилизации.Из данных табл. 1 следует, что как замораживание,так и лиофилизация отрицательно сказываются на калий- транспортирующей активности бактерийПричем после замораживания практичес ки все клетки в популяции сохраняют способность накапливать ионы калия (параметр Нне изменяется), хотя и с меньшей скоростью, по сравнению с контролем (параметр 1/2 увеличивается). После лиофилизации клеток,спо" собных накапливать ионы калия, в по. пуляции уменьшается (параметр Н уменьшился), но у остальных клеток калий"транспортирующая активность изменяется меньше, .чем после эамора живания.П р и м е р 3, Берут бактерии- Е.Со 31, дважды отмытые в дистиллиро" ванной воде, и готовят из них гомо" генную водную суспенэию с концентра 4 ией клеток 10 кл/мл. Суспензию делят на четыре порции: три опытных и одну контрольную. В первую опытную пробу вносят грамицидины Д до кон" центрации 20 мкг/мл. Во вторую опытную пробу вносят этилендиаминтетраацетат натрия (ЭДТА) до концентрации 0,1 мМ. 8 третью опытную пробу вносят ЭДТА до концентрации 0,1 мМ и грамицидин Д до концентрации 20 мкг/мл. В контрольный образец добавок не делают,. Во всех образцах измеряют калий-транспортирующую активность предлагаемым способом.8 табл. 2 представлено изменение параметров калий-транспортирующей активности Е.СЬИ после обработки грамицидином Д.Из данных табл. 2 следует, что после обработки бактерий Е.Сой грамицидином Д в присутствии ЗДТА практически все клетки утрачивают способнрсть накапливать ионы калия из-эа повышенной проницаемости для одновалентных ионов у цитоплазматических мембран, которую индуцируют антибио;. тик, Без ЭДТА мембраны Е.Сой не чувствительны к данной концентрации антибиотика.Предлагаемый способ позволяет по" высить точность определения транспор та ионов калия и может быть исполь" эован для характеристики физиологи5 912752 6ческого-статуса популяции бактерий, щих приемов (замораживания, лиофилиа также целостности их мембран, на- зации) антибиотиков мембранного дейпример, после действия консервирую- ствия,1б л и ц а 1 еПараметры Контроль Заморажи- Лиофилизавание . ция зСмин Н, отн.ед. 10 10 10 Таблица 2 Грамицидин Д ЭДТА ГрамицидинД + ЭДТА Параметры Контроль й,1, мин Н, отн,ед. 12 12 12 форйула изобретения 23Способ определения транспорта ио" нов калия грамотрицательннми бактериями, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью повышения точности способа, суспензию бактерий вносят в раствор сахаровы или маннита в кон,30 центрации 250-00 мМ, затем вводятраствор хлорида калия в концентрации1,0- 10,0 мИ и определяют транспортионов калия регистрацией изменениясветорассеяния суспензии во времени,Источники информации,.принятые во внимание при экспертизе1.Оцг 9 агап 5.Ь., Мага.гозоч 5.М,.Митровка Техред Е. баритончик, Корректор С. Шекма 4еРедактот ЮЮюЗака Ужгород, ул. Проектная,.Филиал ППП "Патент" 316/35 Тираж 505 ВНИИПИ Государственного ко по делам изобретений и о 113035, Москва, Ж, Рауш