Способ определения билирубина в капиллярной крови

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИН ц) 0 01 Н 33/72 ое содержание бил исследуемой кров убина(С) по т исти в сыв форму т ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Белорусский научно-исследовательский институт охраны материнства и дете ва(56) Авторское свидетельство СССР В 976381, кл, О 01 И 33/48, 1983. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИЛИРУБИНА В КАПИЛЛРНОЙ КРОВИ(57) Изобретение .относится к области биологии и медицины, в частности к способам исследования биохимического Изобретение относится к биологиии медицине, в частности к способамисследования биохимического составакрови,Цель изобретения - повышение точности способа.Способ осуществляют следующим образом,С помощью калибровочной кривой,построенной по стандартным образцамс различным содержанием билирубина,разведенным в 10 раз физиологическимраствором хлорида натрия, в исследуе"мом образце капиллярной крови, разве-.денном в О раэ физиологическим раствором хлорида натрия, определяют содержание билирубина (С,), параллель"но определяют коэффициент К в исследуемой крови и с его учетом высчитыБО 1 596255. состава крови. Цель изобретения - повышение точности способа. Способ состоит в том, что капиллярную кровь разводят изотоническим раствором хлористого натрия в 10 раэ и определяют концентрацию билирубина по калибровочной кривой путем прямой Фотометрии. Дополнительно определяют относительный объем плазмы и рассчитывают коэффициент по формуле К 0,9/Ч +0,1, где Ч - относительный объем плазмы.плЗначение концентрации билирубина, определенное по калибровочной кривой, умножают на величину коэффициента. Изобретение повышает точность определения билирубина. 1 табл. ле:С=С К.тКоэффициент К определяют следующимобразом,Пусть взят объем капиллярной крови,равный Х, относительный объем плазмыв котором равен Ч . Для разведенияплкрови в 1 О раз необходимо взять объем физиологического раствора хлориданатрия, равняй 9 Х. Поскольку при разведении капиллярной крови растворомхлорида натрия эритроциты не смешиваются с растворителем и выпадают восадок, истинный объем жидкой частиразведенной крови, т.е. Фактическиразведенной плазмы, составит 9+ЧТаким образом при десятикратном раз 1596255 4"ведении объема Х капиллярной крови9+ЧУ ее разведется в - ф раз, При разЧв ведении стандартных растворов бидирубина, используемых для построения калибровочной кривой, физиологичес" кнм раствором хлорида натрия в 10 раз истинное разведение объема, равногоХ+9 Х Х, составит =10. Поскольку разведения плазмы капиллярной крови и стандартных растворов билирубина неоднозначныпри расчете содержания билирубина в плазме исследуемого об" разца крови (Сследует значение концентрации билирубина, подученное по калибровочной кривой ( С,), умцожить на величину соотношения между разведением плазмы исследуемой крови и разведением стандарта, т.е, на велии щ9+Ч и 9 Ч лЧ, 10 Ч, АО Ча 10 = -ф- +0,1, т.е. 0 9 Чял Кщ ф. - +0,1, а С=С ( в+0,1).09 0,9Ч, 1 ЧМикропипетку объемом 0,1 мл про"мывают гепарином и после проколакопьем кожи пальца пациента набираютв нее до метки 0,1 мп капиллярнуюкровь, которую сразу же выливают впробирку с 0,9 мл 0,9% раствора хлорида натрия. Содержимое пробирки тщательно перемешивают, центрифугируютпри ЗООО об/мин 20 мин и супернатантаккуратно сливают в другую чистуюпробирку. Параллельно в тонкий капилляр набирают кровь для определения.величины К. Определяют оптическуюплотность супернатанта иа спектрофотометре в кювете с рабочим расстоянием1 см при двух длинах волйф 450 нм(Е 4,) и 575 нм (Е), Вычитываютразйость оптических плотностей Е 4 Е 1 и по калибровочцому графику определяют содержание билирубина в пробе (С, ). Высчитывают содержание билирубина в плазме исследуемой крови поформулеСщС К,где С - содержание билирубина в плазме исследуемой крови;С - содержание билирубина в супернатанте;ФК - коэффициент,Для построения калибровочногографика используют готовые наборы 30 35 40 45 10 5(ЧССР). Из каждого стандартного раствора билирубина, приготовленного согласно инструкции, берут по 0,1 мл,добавляют в пробирку с 0,9 мл 0,9%-ного раствора хлорида натрия, тща"тельно перемешивают и фотометрируют на спектрофотометре точно так же, как и опытные пробы. По результатам исследования строят калибровочный график, на оси абсцисс которого откладывают концентрации стандартных растворов билирубина в мкмоль/л, на оси оРдинат - разности оптических плотностей Е -Едля каждого стандартного раствора билирубина; по соответствующим точкам пересечений вычеркивают калибровочную кривуюВ таблице 1 приведены данные сравнительного анализа определения билирубина в капиллярной крови тремя способами: способом-прототипом; предлагаемым способом; путем определения содержания билирубина непосредственно в плазме капиллярной крови методом прямой фотометрии. Как свидетельствуют приведенные в таблице данные, результаты исследо - вания по предлагаемому способу значительно превышают результаты, полученные с помощью способа-прототипа, причем тем в большей степени, чем выше величина К. В то же время они достоверно не отличаются от результатов, полученных при исследовании непосредственно плазмы капиллярной крови.П р и м е р. Микропипеткамн объемом 0,1 мл, промытыми гепарином, вно-. сили по 0,1 мл три различных образца капиллярной крови и выливали в пробирки, содержащие 0,9 мл 0,9%-ного раствора хлорида натрия, Содержимое пробирок тщательно перемешивали, пробирки центрифугировали 20 мин при 3000 об/мин и супернатанты из каждой пробирки переносили в чистые пробирки. Параллельно определяли величину К каждого исследуемого образца капилляр 0,9ной крови К= - - +О,. ОптическуюЧплплотность супернатанта исследуемых образцов капкллярной крови определяли на,спектрофотометре в кювете с рабочим расстоянием 1 см при двух длинах волн: 450 нм (Е ,) и 575 нм (Е 7), против 0,9%-ного раствора хлорида натрия. Высчитывали разность оптичес-.15962 ких плотностей Е , -Е, но калибровочному графику определяли содержание билирубина в пробе (С,) Для построения калибровочного графика использовали готовые наборы Билирубин 115эталон" фирмы нЛахема" (ЧССР), Дляэтого иэ каждого стандартного раствора билирубина, изготовленного согласно инструкции, брали по 0,1 мп, добавляли в пробирку с 0,9 мл 0193-ногораствора хлорида натрия, тщательноперемешивали и фотометрировали наспектрофотометре точно так же, каки опытные пробы, По результатам исследования строили калибровочныйграфик, на оси абсцисс которого откладывали концентрации стандартныхрастворов билирубина в мкмоль/л, наоси ординат - разности оптических 20плотностей Е 40-Е 5.)5 ДЛЯ каждогостандартного раствора билирубина, посоответствующим точкам пересеченийвычерчивали калибровочную кривую.Содержание билирубина в плазме 25исследуемой капиллярной крови высчитывают по формулеС=С, К,где С - содержание билирубина в плазме исследуемой капиллярной 30КРОВИ, МКМОЛЬ/Л;С - содержание билирубина в су 1и ер натант е, мк моль/л;К - величина коэффициента,Получены следующие практическиерезультаты. Образец капиллярной крови 1,ЕЛО О 1001 Е О 030 1д=60 С, (Е , -Е ) =О, 100-01038=0, 06 2 По 40 калибровочной кривой оптической плотности 0,062 соответствует 11,4 мкмоль/л0,9 билирубииа. Коэффициент К=+0,1 =1,6. Следовательно содержание билиру55-.6бина в плазме исследуемо 9 капиллярнойкрови равноС 11,4 1,6 ф 18,24 мкмоль/л.Образец капиллярной крови 2.Е 4 р 0,255;,Е-)5 0,045; 7 я 1 0,48калибровочной кривой оптической плотности 0,210 соответствует 38,6 мкмоль/л0 9б ирубина. Коэффициент К= О 48 +0,1==2,0. Следовательно, содержание вплазме исследуемой капиллярной кровиравнофС=3316 2107612 мкмоль/л.Образец капиллярной крови 3.Е 40 =0 365 Е 516=0 052 Члл-О 33С 1(Е 450-Е) -О, 365" О, 052=0, 31 3. Покалибровочной кривой стандартногораствора билирубина, по соответствую"щим точкам пересечений вычерчиваликалибровочную кривую.Содержание билирубина в плазмеисследуемой капиллярной крови высчитывали по формуле С=162,8 мкмоль/л.формула изобретенияСпособ определения билирубина вкапиллярной крови путем прямой фотометрии образца крови, разведенногоиэотоническим раствором хлористогонатрия, с последующим определениемконцентрации билирубина по калибровочной кривой, О т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышенияточности в пробе крови дополнительноопределяют относительный объем плазмы, рассчитывают коэффициент поформулеК -+0,1,0,9где К - коэффициент;Ч- относительный объем плазмы,и значение концентрации билирубина,определенное по калибровочной кривой,умножают иа величину коэффициента,1596255ФЮМВЮФНВ Способ ееейеюйвйеМФвйейе Прототип Уровень значимости (Р), мнвМеюю Предлагаемый Прямой метриифотоплазмы ФНВМИВею0,41 мэеаюмаеаеа 0,50йаФИаайющвютвеП р и м е ч а й и е. Статистическая обработка проведена по результатам исследования пяти параллельных проб каждого образЧЯьКорректор,С. Шевкун Подписное 3ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5