Способ определения концентрации ионов кальция в растворе

в растворе, измеренные в присутствии различных концентраций ионов Мя2+П р и м е р 1. На кварцевую пластину размером 8 х 20 мм толщиной 1,5 мм наносят 1 мг лиофилизованного,кислоторастворимого коллагена и раство,ряют его в 100 мкл 0,05 М уксусной кислоты, а затем добавляют 0,5 мг лио-. Филизованного парвальбумина, размешивая смесь до полного растворения. и распределяя ее по поверхности пластинки в виде пятна (диаметром 5 мм). После этого смесь высушивают на возду хе, а затем. вымачивают в растворе 50 мМ трис-НС 1, рН 7,0-7,5, подсушивают на воздухе до испарения капель и выдерживают некоторое время над парами глютарового альдегида в замкнутом объеме. После этого чувствитель ный элемент вымачивают в 50 мМ трисНС 1, рН 7,0-7,5, в течение 20 мин и высушивают на воздухе. Полученная таким способом пленка прочно удерживается на кварцевой пластинке, поз воляя воспроизводимо проводить измерения (более 5000 циклов собственно измерений с последующей отмывкой чувствительного элемента) в течение 6 мес. Достоинством предлагаемого способа является отсутствие высоких требований к равномерности чувствительной пленки, небольшое (менее 1 мг) количество белка на один чувствительный элемент и высокая (за счет иммобилизации) его механическая прочность.Для получения калибровочной кривой чувствительный элемент на кварцевой пластинке помещают в измерительную кювету с кальций"ЭГТЛ буфером, задавая различную концентрацию свободного кальция. С помощью спектрофлюориметра измеряют положение максимума спектра триптофановой Флюоресценции иммобилизованного парвальбумина, строя калибровочную кривую - зависимость положения максимума спектра Флюоресценции от десятичного логарифма концентрации свободного кальция (фиг. 1, кривая 1). После калибровки чувствительный элемент помещают в буферный раствор 10 мМ трис-НС 1, рН 7,0, приготовленный на дистиллиро" ванной воде, и измеряют максимум спектра его триптофановой Флюоресценции, который в данном случае был на 33510,5 нм, По калибровочной кривой это соответствует десятичному логарифму концентрации свободного кальция (-5,20, 1), что хорошо согласуется с величиной, полученной из измерений методом атомно-абсорбционнойспектрофотометрии (-5,3). Из приведенного видно, что использование предлагаемого способа позволяет при маломколичестве парвальбумина, используемого на изготовление чувствительногоэлемента, при простоте изготовленияи низких требованиях к равномерностираспределения белка по поверхностикварцевой подложки обеспечить оченьвысокую точность опредения ионовкальция,Как видно из фиг. 1, предлагаемыйспособ позволяет определять концентрацию свободного кальция в растворев диапазоне 10-10 моль/л не хуже,чем у прототипа, причем, как видноиэ фиг. 2, эта чувствительность практически не изменяется в диапазонерН 6,7 - 7,5. Кроме этого, как видноиз фиг. 1, время выдерживания в парахглутарового альдегида (от которогозависит степень поперечного сшиваниябелков) является удобным параметромдля регулировки чувствительности (на;клон градуировочной кривой) датчикав узких диапазонах концентрации ионовкальция. Полученные коэффициенты селективности предлагаемого устройства к ионам магния значительно ниже таковых для известных ионселективных электродов, При концентрациях свободного кальция в растворе от 10до 10моль/л величина коэффициента селективности к магнию лежит в диапазоне от 2 10 до 2 10 при изменем з нии концентрации магния от 10 до 10 моль/л. При концентрации кальция выше 10 моль/л коэффициент селективности к магнию становится меньше 10В условиях определения селективнос" ти, приведенных в описании прототипа (1 мМ Мр. ), коэффициент селективносгти предлагаемого способа составляет 0,9 10 7 (для прототипа 3,6 10 ).Коэффициенты селективности к ионам натрия и калия в присутствии 100 мМ-т Наф и К составляют 2 10 (5, 3 10 ) и 210 (2,110) соответственно (в скобках данные для прототипа).П р и м е р 2. Определение концентрации кальция в плазме крови собаки, 5 158Приготовленный, как описано в примере 1, чувствительный элемент, представляющий собой пленку коллагена с иммобилизованным парвальбумином, нанесенную на кварцевую пластинку, предварительно освобожденный от Сагь с помощью раствора 10 М ЭГТА рН 8) и отмытый от ЭГТА в деионизованной воде, помещают в разбавленный в 10 раз раствор плазмы крови собаки., Через несколько минут пластинку с чувствительным элементом вынимают из раствора, капли раствора на ней удаляют встряхиванием и с помощью фильтровальной бумаги, а затем помещают ее в кюветное отделение спектрофлуориметра, приспособленного для регистрации излучения с передней поверхности образца, и измеряют спектр триптофановой флуоресценции парвальбумина. По положению спектра флуоресценции, пользуясь заранее полученной калибровочной кривой чувствительного элемента, определяют концентрацию свободного кальция в растворе, которая оказалась равной 2,2 мМ. Это хорошо согласуется с данными, полученными наЛЩрНМ 0256 6том же растворе с помощью коммерческих кальцийселективных электродовфирмы "Огхоп" (1,7 мМ) и фирл 1 ы "Ка а 1 отеего 11.8 М).Формула изобретенияСпособ определения концентрацииионов кальция в растворе путем помещения ионоселективного элемента в исследуемый раствор с последующей регистрацией изменения физического по, казателя в нем, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, а также селективноети при исследовании растворов в присутствии ионов магния, в качестве ионселективного элемента используют парвальбумин, иммобилизованный на коллагене, путем смешиванияпарвальбумина с коллагеном, формирования пленки и обработки ее парамиглутарового альдегида в течение 530 мин, а в качестве физического показателя регистрируют измененияспектра триптофановой флуоресценции парвальбумина.15 ЫО)56 7 0 Са фф фоаЗСоставитель А.АгуреевРедактор С.Пекарь Техред Л.Сердюкова Корректор А.Осауленко Гагарина, 10 оизводственноз 2008 пи ГосудаЗаВНИИ Тираж 512 Подписноевенного комитета по изобретениям и открьггиям при ГКНТ СЧС 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 ельский комбинат "Патент", г. Уж