Способ моделирования оценки типа комбинированного токсического действия малорастворимых пылей

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИН 97 рЗ)5 С 01 Н 33/53 САНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ЕТЕЛЬСТВУ Н АВТОРС 14 илог енке (адтаск ои ко исутний.овыбГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Свердловский научно-исследователь-ский институт гигиены труда и профзаболеваний(56),Постановка экспериментальных исследований по изучению характера комбинированного действия химических веществ с целью разработки профилактических мероприятий, Методические рекомендации. Утв. эам,главного госуд. санит. врача СССР А.И.Заичнеко,В 4050-85, 06,12,85, - М 1987)с. 1-47. Изобретение относится к медицне, а именно к гигиене и токсики касается экспериментальной оцтипа комбинированного действиядитивного потенцирования или ангониэма) малорастворимых токсичпылей на организм, осуществляемцелях обоснования их гигиеничесрегламентации при совместном прствии в воздухе рабочих помещеЦелью изобретения является ишение воспроизводимости.Способ осуществляют следующимразом,2(54) СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ОЦЕНКИ ТИПА КОМБИНИРОВАННОГО ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ МАЛОРАСТВОРИЫХ ПЫЛЕЙ(57) Изобретение относится к медицине, а именно к гигиене и токсикологии и может быть использовано при оценке типа комбинированного действия мало- растворимых токсических пылей на организм,. Цель - повыщение воспроизводимости. Белым крысам интратрахеально . вводят по 1 мл суспензии исследуемых веществ, через 24 ч под гексеналовым наркозом проводят рассечение трахеи, бронхоальвеолярный лаваж и подсчет альвеолярных макрофагов, нейтрофилов. Затем строят уравнение регрессии по дозам входящих в комбинацию веществ с учетом их взаимовлияния, причем в качестве основного выбирается тот тип комбинированного действия, на который указывают не менее 753 исследуемых показателей, 1 табл. аьБелым крысам одного пола, возраста и близкой массы тела интратрахеально вводят по 1 мл стерильного физиологического раствора или по 1 мл суспензии исследуемых веществ (изолированно либо в комбинации), Комбинации доэ подбираются в соответствии с изЭвестными принципами планирования двух- фф факторных экспериментов, й.Учитывая, что многие показатели реакций альвеолярного фагоцитоэа (РАФ) отражают,не только прямое повреждающее или стимулирующее действие отложившихся в альвеолярной об 1569709ласти частиц, но и более или менее сложно опосредованные компенсаторные сдвиги, и что зависимость последних от степени токсичности частиц и их дозы носит заведомо нелинейных харак"5 тер, за основу планирования эксперимента принимают двухфакторный эксперимент с тремя уровнями для каждого фактора (матрица плана 3 ), дающий возможность построить уравнение регрессииУ=ЬО+Ь Х,+Ь Х,+ЬХг+ЬггХ +Ь ХХу,(1)где ЪЬ,Ь,ЬгЬ г г Ь,г - коэффициентыХ и Х - дозы факторов (пы 1лей),Наряду с этим, дополнительная информация может быть получена натом же экспериментальном материалепри вычленении из него данных соот 1ветствующих матрице плана 2, с по-,строением для каждого сочетания уровней факторов уравнений регрессии25У=Ъ+Ь Х +Ьг Х г+Ь 1 Х Х г(2)При этом,в качестве минимальногоуровня действия каждого фактора прини,мают отсутствие данной пыли в комбинации, два других уровня подбирают впредварительных экспериментах такимобразом, чтобы по изучаемым показателям имелось четкое усиление эффекта с увеличением дозы вводимой пыли. 35Однако нежелательно, чтобы суммарная доза пылей, вводимая при комбинировании максимальных доз каждой, пре.вышала 10 мг, так как более высокиепылевые нагрузки искажают картину 40РАФ и ее зависимость от дозы.Через 24 ч после интратрахеального введения у крыс под гексеналовымвнутрибрюшинным наркозом через надрез в трахее и введенную в него каиюлю промывают легкие 1 п вд 1 и однократно 10 мл стерильного физиологического раствора (бронхоальвеолярныйлаваж (БАЛ), Весь объем извлеченнойиз легких жидкости за исключением 50небольшой порции, необходимой для подсчета общего числа клеток в ней обычным меланжерным способом, подвергается центрифугированию при 200втечение 4 мин, Иэ осадка готовят мазок, который просушивают на воздухе,фиксируют метанолом и окрашивают поРомановскому,При микроскопировании 100-200 клеток с иммерсионным объективом подсчитывают процент альвеолярных макрофагов (АМ), нейтрофильных лейкоцитов(НЛ) и прочих клеток, определяютпроцент явно дегенерированных АМ, измеряют средний диаметр АМ, подсчитывают среднее число фагоцитированныхчастицв одном АМ и одном НЛ, На основании этих данных рассчитывают отношение НЛ/АМ, абсолютное число НЛ иАМ в БАЛ, общее число частиц во всехАМ и НЛ, а также их сумму, Наиболееинформативными и надежными для характеристики пульмонотоксичного действия пылевых частиц являются показатели общей клеточности, абсолютногочисла НЛ, численного соотношенияНЛ/АМ,Дпя каждого из перечисленных показателей получают значения коэффициентов уравнений регрессии (1) или (2),Статистическая значимость коэффициентов полинома оценивают по критерию 1 Стьюдента, воспроизводимостьданных - по критерию Кохрена, точностьаппроксимации - по средней ошибкеаппроксимации. Модель считаютадекватной, если расчетные показатели укладываются в 957 доверительные интервалы экспериментальных данных.При анализе уравнений регрессииучитывают не только статистически значимое отличие от нуля значения коэффициента Ъ и его знак, свидетельствующие о достоверности, степени и знаке отличия эффекта комбинированноговоздействия от алгебраической суммыэффектов каждого, а принимают во внимание направленность влияния изолированных факторов на оцениваемый показатель РАФ, Если один из факторов(пылей) увеличивает этот показатель,а другой снижает (т,е, коэффициентыс индексами 1 и 11 имеют один знак,а с индексами 2 и 22 - другой), тодаже при значении коэффициента Ъг,значимо не отличном от нуля, алгебраическое суммирование членов полинома соответствует в токсикологическомпонимании антагонистическому действию,При разных знаках коэффициентов Ь и Ь (соответственно Ьг и Ьг)11преобладает знак линейного члена поли- нома, если сила соответствующего фактора не превышает величину Ь 1(Ь 1, ),25 5 ,15697соответственно Ь (Ь г), при большейсиле фактора преобразуется знак не-:линейного члена, т,е в этом случаепри разных уровнях и соотношениях5доз действие комбинируемых пылей наданный показатель может оказатьсякак одно-, так и разнонаправленным,Кроме того, принимают во вниманиехарактер и физиологический (или токсикологический) смысл данного показателя. Например, если среднее число пылевых частиц в единичном АМ прикомбинированной пылевой нагрузкезначимо выше алгебраической суммы 15влияний изолированных Факторов на этот.показатель (т,е, коэффициент Ь 1 статистически значимо больше нуля), тоэто свидетельствует о взаимном ослаблении цитотоксического действия частиц, т,е, не о потенцировании, а обантагонизме.С учетом указанного определяют, покаким показателям РАФ имеет местоаддитивный тип комбинированногодействия, по каким - более аддитивного (потенцирование), по каким -менее аддитивного (антагонизм) или явная противонаправленность действия.При выборе основного типа действия30(в соответствии с определением этогопонятия методическими рекомендациямиМЗ СССР В 40-50-85) учитываются встречается ли этот тип по наибольшему числу показателей РАФ и/или при наибольшем числе вариантов доз, а также насколько токсикологически значимы этипоказатели. Отдают предпочтение томутипу действия, который выявлен попоказателям РАФ, перечисленным в ка Очестве наиболее информативных. Вместе с тем при трактовке уравнений регрессии с учетом сделанных указанийнесовпадение оценок по разным показателям РАФ является достаточно редк им,П р и м е р, Результаты экспери-.мента, проведенного с частицами двуокиси марганца и хромата бария, растертых до близкой дисперсности, соот рветствующей обычному распределениючастиц по размерам в производственныхаэрозолях дезинтеграции, Для обоихвеществ взяты уровни до 2,5 и 5,0 накрысу. Эксперимент н девяти вариантах комбинирования, соответствующихплану матрицу 3 , проведен в шестиповторностях (т,е, в сумме на 54 животных) Критерию воспроизводимости 09 6уравнение регрессии (1) отвечало пошести показателям РАФ: общая клеточность БАЛ, абсолютные числа АМ и НЛ,коэффициент НЛ/АМ, средний диаметрАМ, общее число фагоцитированныхчастиц во всех АМ и НЛ,Для всех показателей, информативных с точки зрения оценки пульмонотоксического действия, вклад Фактора Х (соответствующего двуокиси маргганца) выше вклада Фактора Х 1 (хромата бария), что дает согласованнуюоценку первой пыли как более токсичной, о том же свидетельствует и сравнение групп, получивших равные дозы.той или иной пыли, по показателюпроцента дегенерированных АМ, Повсем шести показателям, кроме послед"него, анализ полинома (1) выявляет/либо противонаправленность эффектов,либо. комбинированный эффект менееаддитивного для любых или преобладающих сочетаний доз, По последнему изуказанных показателей положительныйкоэффициент Ь также отражает, комбинированный токсический эффект менееаддитивного, Значения коэффициентовполинома для шести показателей приводятся в таблице,В качестве примера явной противо- направленности действия хрома и марганца, дополнительно усиливаемой отрицательным значением коэффициента Ь г, можно привести уравнение регресссии для среднего диаметра АМ7=39, 3+3, 75 Х+О, 51 Х,-2, 75 Х г - -О, 22 Х -О, 25 Х Х (мкм) . Следующее уравнение регрессии(для общей клеточности БАЛ) приводится как пример комбинированного эффекта менее аддитивного при однонаправленности действия факторов (противонаправленное действие фактора Х г,т.е, двуокиси марганца, может проявиться только при дозе более чем1,34:0,02=67 мг, которая заведомо зна"чительно выше допустимой при интратрахеальном введении и в расчет может не приниматься).У=(4,01 +0,19 Х,+0,06 Х,+1,34 Х, --0,02 Х .-0,79 Х Х ) 10(клет),Как по тем же самым шссти показателям РАФ, так и еще по семи другим. (среднее число частиц в одном АМ, то1569709 Показатель РАФ КоэФфициенты Общая клеточнасть х 10 Число АМ х 10 Число НЛ х 10с НЛ/АМСредний диаметр АМ, мкм Общее число фагоцитированных частиц в БАЛ х 10-2,75 39,3 0,51 3,75 26,6 9,85 -1,10 10,25 -0,67 0,65 же, в одном НЛ, соответствующая сумма частиц во всех АМ, то же, во всехНЛ, процент АМ, процент НЛ, процентдегенерированных АМ) получены урав 5кения регрессии (2), отвечающие условиям адекватностии воспроизводимости, Так как отличные от нуля уровни воздействия комбинировались в четырех дозовых сочетаниях, то это дает в общей сложности 52 уравнения.При этом только восемь из них свидетельствуют,о возможности комбинированного действия более аддитивного,в остл:нных 44 случаях - явньп анта"гонизм (противонаправленность эффектов) или действие менее аддитивного,причем отличие от аддитивности вбольшинстве этчх случаев статистически значимо. 20Таким образом, предлагаемый способдает возможность дополнить комплексметодов ускоренной экспериментальнойоценки типа комбинированного действияхимическихвеществ новымметодом, адекватным задаче такой оценки в случаемалорастворимых токсичных пылей, длякоторого она наименее разработана вцелом, сочетать специальное исследование того, как проявляется комбинированное дейсТвие на уровне реакции альвеолярного фагоцитоза (имеющей важнейшее значение для прогнозирования токсикокинетических особенностей комбинированного действия малорастворимыхпылевых частиц, а также пульмоноток"сичности такой комбинации с возможностями ускоренного прогнозированияосновного типа комбинированного ре зорбтивно-токсического действия на 40организм в целом,Способ основан на простых и хорошо воспроизводимых цитологических показателях и не требует дорогостоящего оборудования, а использование методов математического планированиясводит к минимуму расход, животных,Способ сочетает свойственную клеточным тестам более широкую биологическую обобщенность оценки и высокуюстатистическую надежность показателей, получаемых при подсчете сотенклеточных элементов, с учетом реакциицелостного организма на цитотоксическое действие пылевых частиц.Использование изобретения позволяет сократить время исследования доодной недели (вместо 4 мес в извест-ном способе), снизить трудоемкость иповысить точность оценки типа комбинированного действия малорастворимыхпылей,Формула изобретенияСпособ моделирования оценки типа комбинированного токсического действия малорастворимых пылей путем введения в легкие экспериментального жи" ватного исследуемых пылей с последующим излучением ответной реакции организма, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что с целью повьппения воспроизводимости, исследуемые пыли вводят интратрахеально и через 24 ч проводят бронхоальвеолярный лаваж, центрифугируют и затем микроскопируют клеточный осадок, исследуют цнтологические показатели реакции альвеолярного фагоцитоэа для построения уравнений регрессии этих показателейпо дозам, входящим в комбинацию веществ с учетом их взаимовлияния, причем в качестве основного выбирается тот тип комбинированного действия, на который указывают не менее 753 исследованных показателей.