Способ определения количества и консистенции сырой биомассы

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИН 8 51)5 С 01 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ов и Б,В,Сахаро88.8) н ич Р Ра 1 С 1+С оличество В сырои биомассы и ее ю К находят по Формула конси стВСС В2 илР Изобретение относитсянологии и может быть исполв медицинской, микробиоло иоте овано еской эконГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии(56) Плевако Е,А. Сушеные хлебопекарные дрожжи. М.: Пищепромиздат, 1953. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА И КОНСИСТЕНЦИИ СЫРОЙ БИОМАССЫ (57) Изобретение относится к биотехнологии и направлено на повышение точности определения количества и консистенции сырой биомассы, В ампулу для ЯМР-анализа заранее вводят 5-50 мкл концентрированного раствора парамагнетика, не проникающего через клеточные мембраны, Затем в ампулу отбирают образец клеточной сус - пензии и тщательно перемешивают. Аьг пулу помещают в датчик ЯМР-релаксометра и регистрируют релаксационное изменение амплитуды сигнала ЯМР,Полупищевои промьппленности при пр одстве бактериальных препаратоЦель изобретения - повьппение ости определения количества и истенции сырои биомассы,Сущность изобретения заключа том, что сокращаются времена Тп ЯМР-релаксации протонов вн,801566274 А 1 ченную кривую разлагают на сумму двух экспонент быструю и медленную, связанных с релаксацией протонов вне- и внутриклеточной воды, и находят начальные амплитуды этих компонент Рп и Ра Затем исходный образец разбавляют в Н раз (М = 2-5) питательной средой или физраствором,содержащим парамагнитное вещество в той же концентрации, и вновь измеряют амплитуды сигналов Ра и Р внутая пп ри- и внеклеточной воды. По полученым величинам рассчитывают содержание С сухого вещества биомассь 1 и кол ество внутриклеточного 1 и внеклеточной Е воды в образце клеточной воды при добавлении в сус пензию клеток парамагнитного вещест ва,не проникающего в клетки.Это дае возможность разделить сигналы прото нов внутри- и внеклеточной води.Высокая проницаемость клеточных мембран приводит к быстрому обмену моле кулами воды между внутри- и внеклеточным объемами, что изменяет ампли туды быстрой (внекпеточной) и медленной (внутриклеточной) компонент25следующим Способ осуществляютобразом,В ампулу для ЯМР-анализа заранеевводят каплю (5-50 мкл) концентрированного (0,1-1 М) раствора парамагнетика, как правило МпС 1, затем отбирают образец клеточной суспензии(0,5-1,0 мл) помещают в ампулу итщательно перемешивают для равномерного распределения парамагнетика пообъему образца, Далее ампулу помещают в датчик ЯМР-релаксатора и регистрируют релаксационное изменение амплитуды сигнала ЯМР с помощью одной изизвестных импульсных последовательоностей, например, 90-1801 ЯО(Т ) или 180-90 (Т). Полученнуюкривую разлагают на сумму двух экспоненциальных компонент и определяютих начальные амплитуды Р а, и Рв 1,Какследует из Лиг,2, при концентрацииМпС 1 больше, чем 10 мМ Ро, практически постоянна и соответствует долевнутриклеточной воды в образце суспензии, При этом времена ЯМР-релаксации внутри и внеклеточных протоновотличаются более чем в 20 раз (Та//т20). Таким образом, введениее анализируемый образец парамагнетика в концентрации, обеспечивающей20-кратное различие времен релаксации быстрой и медленной компонентсигнала ЯМР, обеспечивает точное измерение амплитуд этих компонент,50 55 сигнала ЯМР-релаксации и не позволяет точно определить количество водывне и внутри клеток. Повыщая концентрацию парамагнитного веществаво внеклеточном объеме, можно значи 5тельно сократить время релаксациивнеклеточных протонов и выполнитьизмерение амплитуд сигналов ЯМР завремя более короткое, чем время обмена молекулами воды через мембрану,На Лиг.1 показаны типичные релаксационные кривые для суспензий клеток микроорганизмов разных концентраций; на Йиг. 2 - зависимость вре,мени релаксации внеклеточных протонов Т , отношение Т /Тв Временирелаксации Внутриклеточных протоновк времени релаксации внеклеточныхпротонов и амплитуды Ра сигналапротонов и внутриклеточной воды клеток дрожжей БасЬагощусее сегеч 1.В 1.ае, от концентрации парамагнитных ионовМп в суспензии клеток, Ватем исходный образец клеточной биомассы разбавляют в И раз (И =2 - 5) питательной средой или изотоническим Физраствором, содержащими парамагнитное вещество в той же кон 1 Е 1Р =Р (1) а 1+Е, У 91 1+Е, 9 где 1 - количество внутриклеточнойводы в исходном образце клеточной биомассы, а Еколичество внеклеточной воды в этом образце.Аналогичные соотношения можно записать Для Величин Ра и РВ 1 Е р Р (2) а 1+ Ев 1+ 2 2где Е - количество внеклеточной во -ды в образце, разведенном11 раз питательной средойили Физраствором. С учетом того, что Е = (1+С+Е 1), И, где С - количество сухого остатка после высущивания клеточной биомассы, из (1) и (2) следует: Ра 1 ЫРаРа 1 Рв 1 Рв, Ра РВ 1Е1+С По полученным С, 1 и Енаходим-" количество сырой биомассы С + 1ВС+ 1+ Е и консистенцию сырой биомассы В Е С+ 1КЕ П р и м е р. Определение количества и консистенции сырой биомассы пекарских дрожжей,Пробу клеточной суспензии дрожжей, объемом 0,5 мл с помощью пипетки переносят в ампулу для ЯМР-измерений, в которую предварительно внесено 1 О мкл 500 мМ раствора МпС 1 ,в воде и перемешивают. Методом Карра-Парселла на приборе "Миниспекирс" измеряют времена релаксации (Та,Тв) и амплитуды компонент центрации и измеряют амплитуду сигналов Р и Рв внутри и внеклеточной воды.Для Величин Ра, и Рв, можно записать следующие соотношения:(Р Р ) сигнала ЯМР внутри ип фвнеклет очных пр от онов воды. В данномслучае они составили Тда = 27 мс,Т = 1,8 мс, Р = 0,44, Р,= 0,56.Затем в ампулу дополнительно вводят 0,5 мп физраствора с 20 мкл100 мМ МпС 1 так, чтобы объем пробыувеличился вдвое (И = 2) и снова производят ЯМР-.измерения, В результатеполучилось Та = 24 мс, Тц = 1,5 мс.Подставляя эти значения Ра Фрв иИ в формулы, получаем044 - 2 0200,44 0,8-2 0,55 0,200 313 г/млр1= - - - =0 340 441,3130 56Е = -= 0 4341,313 ф1 + СВ = ----- = 0 603 г/л1+ С+ ЕФК= - -=1 414.Вр 1 66274 6В случае, когда содержание сухого вещества в клетках известно заранее, процедура определения количества и консистенции клеточной суспензии упрощается, Клетки крови человека в среднем содержат 71 воды и29 Х сухого вещества, т.е. С=0,29(4),Для определения гематокрита (количества клеток) предлагаемым методомдостаточно измерить Р и Рб неразведенной пробы крови, причем для анализа достаточно капли крови объемом100-200 мкл, В качестве примера1 О мкл МпС 1 100 мМ концентрациивводят в ампулу для ЯМР-измерении,затем добавляют 200 мкл консервированной крови человека и тщательно пе ремешивают, затем,с помощью ЯМР-релаксометра определяют Р и Ра. Сучетом 57.-го разбавления растворомпарамагнетика, их значения оказалисьравны соответственно Р = 0,31,Рв(долях) к сырому весу клеток крови,то определение гематокрита (Г) и консистенции (К) крови сводится к вычислению выражений30 Ра 0,31 1 - сР 1-0,29 0,69П р и м е р 2. Аналогично примеру 1 определяют значения Р , Р и ТО Ф теь неразбавленной клеточнойсуспензии, Получают Ра = 0,44,В = О 56, Та = 27 мг, т = 1,8 мг, Затем исходную суспензию разбавляют в 5 раз (И = 5)о Для этого к 0,5 мл суспензии клеток добавляют 2 мл физраствора с 40 мкл 500 мМ раствора МпС 1. Отбирают пробу 0,5 мл в ЯМР-ампулу и измеряют РаРь ю т а и тьОни составляютР, = 0,075, Рьэ = 0,925,т -- 28 мс, т: 1,6 мс.Следовательно044-50 0750,44-0,925-5 0,56 ф 0,075= 0,325, тогдаВ = 0,6 и К = 1,41, что практически совпадает с результатами предыдущего измерения (при Х = 2). П р и м е р 3. Определение гематокрита и консистенции донорской крови человека.= 0,63,Формула и з обретения Способ определения количества и 50консистенции сырой биомассы путем иэмер ения объемов внутриклеточной 1 и внеклеточной Е воды соответственно, содержания сухого вещества С в образце и расчета количества В сырой биомассы и ее консистенции К по формулам С+ 1С+ 1+Е ф 40Полученные результаты совпадаютс известными данными, где используется я метод це нтрифуги ров ания с поправкой на интерстициальную воду. Вто же время предлагаемый способ значительно экспресснее (5 мин) и требует меньшего количества крови,1566274 ВВ/Е,Рд - НРаа 3.РО, Р 61 11 Рв, Ра Ра РвТР т 11 С1+С ф где Ы - кратность разведения,15 ъ УОщ. Составитель Н,Алкее, 11 атрушева Техред М, Дидык М,Иароши акт ор аказ 12 Тираж 4 одпи сно е НИИПИ Государств 1о изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР35, Раушская наб д, 4/5 ного комитет 035, Москва,Производственно-издательскнй комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101 отличающийся тем,что, с целью повьппения точности, в обра" зец вводят парамагнитное вещество в концентрации, обеспечивающей различие времен ЯМР-релаксации протонов внутри- и внеклеточной воды не менее, чем в двадцать раз, методом ЯМР-релаксации измеряют амплитуды сигналов Р и Рв, внутри- и внеклеточной аводы соответственно, разбавляют образец в 2-5 раз питательной средой или изотоническим физраствором, содержащими парамагнитное вещество в тойже концентрации, измеряют амплитудысигналов Р и Рв внутри- и внеклеточной воды, а величины 1, Е иС определяют по формулам