Способ определения активированных нейтрофильных лейкоцитов

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИН А 1 4 С 01 НЗЗ/ ЕНИЯ ИЕ ИЭО УСВИДЕТЕЛЬ И ВТОРСН ним тетразоли фильных лейко м в цито итон сме им светом ой волны возбуждаюнохроматиче скспектра с длин далее удаляют оранжевым све нием в област чию люминесце 20"7 1968,2,ИВИРОВАНГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ ССПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫ(71) Кубанский государственный медицинский институт нм. Красной Армии(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИИ АКТНЬИ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ(57) Изобретение относится к гемоцитологии, После инкубации с нитросиО 139412 плазме нейтроь облучают мовидимой части 460-490 нм, щее излучениес пропусканм и по налик определяют льные лейкоповысить точ днем в 4,8 раставляет 2,57 активированные нейтрофи циты, Способ позволяет ность определения в сре за, ошибка в среднем со 2 табл.Изобретение относится к гемоцитологии и может быть использовано в гематологии, иммунологии, хирургии,терапии, педиатрии, фтизиатрии, при ин фекционной патологии для оценки функционально-метаболическоо состояниянейтрофильных лейкоцитов с целью диагностики бактериальных инфекций.Целью изобретения является повы 10шение точности способа.Сущностью изобретения. являетсявозбуждение люминесценции в цитоплазме активированного нейтрофильного лейкоцита монохроматическим излучением видимой части спектра с дли ной волны 460-490 нм с последующимизмерением интенсивности люминесцен"ции активированных нейтрофилов (ИЛАН)фотоэлектрическим или другим объективным методом,Предлагаемый способ основан наоткрытом явлении: после инкубации снитросиним тетразолием (НСТ) в цитоплазме нейтрофильных лейкоцитов при 25облучении их монохроматическим светом с длиной волны 460-490 нм возникает интенсивная собственная люминесценция, не связанная с содержащимся в клетках Формазаном. Люминесцируют только нейтрофилы, составляющие НСТ в Формазан. Способностью восстанавливать НСТ обладают активированные стимулирующими факторами нейтрофилы. Клетки, не восстанавливающие НСЪ, не люминесцируют, Это позволяет считать доказанным, что люминесценция возникает именно в активированных нейтрофильных лейкоцитах.Свечение выявляется в нейтрофилах,содержащих.в цитоплазме не только40глыбки и крупные гранулы Формазана,но и мельчайшую пылевиднуюзернис.тость, которая в известном способевовсе не учитывается. Отложения формазана в цитоплазме нейтрофилов самипо себе не светятся", люминесценциялокализуется в участках цитоплазмы,свободных от Формазана. Таким обра"зом, в предлагаемом способе критериемстепени активации нейтрофильных лейкоцитов является интенсивность люминесценции клетки, а не количествоформазана в ней.Для возбуждения люминесценции вкачестве источника света можно применять как ртутную лампу сверхвысокого давления ДРШ 250-3, так и галогенную лампу КП 1-9-70, обладающую непрерывным спектром, ИЛАН нескольковозрастает при изменении длины волнывозбуждающего света от 460 до 490 нм(табл. 1).П р и м е р. Берут каплю крови изпальца больного С. Диагноз - ожоговаяболезнь, осложнившаяся сепсисом. Каплю наносят на предметное стекло, добавляют 1 каплю гепарина (10 ед. в1 мл Физиологического раствора), смешивают с 1 каплей 0,1 -ного растворанитросинего тетразолия в дистиллированной воде, рН 7,0. Проводят инкубацию в термостате 15 мин при 37 С,затем 15 мин при 20 С. Удаляют излишек инкубационной смеси, высушиваютпрепарат на воздухе.Для измерения ИЛАН помещают препарат на предметный столик микроскопа - цитофлуориметра "Люман-ИЗ" с фотометрической люминесцентной насадкойФИЭЛ. Освещают препарат сверху через опакиллюминатор и объектив по методу светлого поля. Устанавливаютвозбуждающий интерференционный светофильтр с максимумом пропускания470 нм и полушириной полосы пропускания 8 нм. Устанавливают "запирающий", оранжевый светофильтр с полосойпропускания 520-700 нм. Наносят напрепарат каплю нелюминесцирующегоиммерсионного масла, наводят люминесцентный объектив, апертура 1,25.Цитофлуориметром измеряют интенсивность люминесценции 50 нейтрофильныхлейкоцитов. Регистрацию анодного то"ка Фотоэлектронного умножителя ФЭУ осуществляют цифровым измерительнымкомплексом Р 385 К, в состав которого входит вольтфарадоомметр Р 385.Результаты измерений через транскриптор ф 5033 и блок связи Р 385 К фиксируют цифропечатающей машиной ЭУМ 23 Д. Полученные индивидуальные значения интенсивности люминесценции 50активированных нейтрофилов складывают, делят на 50, получают в пересчете на одну клетку значение ИЛАН3,08 отн, ед что диагностирует наличие септического процесса (бакте-риальной патологии), так как ИЛАНболее 3,0 ед.Проведены измерения интенсивностимаксимума в спектре люминесценцииактивированных нейтрофилов при различной полосе пропускания "запирающе го" св е то филь тра,Результаты представлены в табл.1,1394128 Т а б л и ц а 1 в 4,8 разаспособом,В табл. Полоса про пускания "запирающего" светофильтра,рм параметров излучения,При Л воз 6= При Л об 490 рм460 нм Таблица 2 Длина волны возбуждающего излучения, нм Интенсивность мак 1 О 4,7 350-520 520-700 700-900 3,2 41,9 50,2 400 20,6 0,0 0,0 420 35,8 41,9 460 50,2 490 Иртерсинность максимума в сне ктре люмире сцен ции, %5 Примечание. Л - длина волны возвоз 6буждающего излучения. Как видно из табл. 1, полоса про 20 пускания запирающего светофильтра 520-700 нм является его оптимальным параметром как при длине волны возбуждающего излучения 460 нм, так и прр 490 нм.Точность диагностики лабораторного теста характеризуется количеством истинных (т.е. соответствующих состоянию обследуемых пациентов) реэульта 30 тов, а также диагностической эффективностью теста случайных ошибок измерений.Предпринято измерение ИЛАН в сравнении с визуальной оценкой НСТ-теста в четырех мазках крови (двух здоро- З 5 вых людей и двух больных сепсисом) опытными микроскопистами "слепым" методом в числе других препаратов. В каждом мазке измерение ИЛАН и подсчет НСТ-теста произведены по 20 раэ 40 повторно. Каждый раз измерению или подсчету в пределах мазка подвергали 100 рейтрофильных лейкоцитов.При визуальном подсчете ошибка метода (коэффициент вариации) колеблет ся от 9,4 до 14, 3%, составляя в среднем 12,1%. Особенно высока ошибка при подсчете клеток у больных, что объясняется цитологической картиной в этих мазках и связанными с рей субъективными сложностями типирования рейтрофилов, При измерении ИЛАН ошибка ко леблется от 2,0 до 2,9%, в среднем составляя 2,5%. В мазках здоровых и больных людей ошибка сходна. Таким образом предлагаемый способ позволяет повысить точность определения активироваррых нейтрофилов в среднем ро сравнешпо с известным 52 обоснована оптимальностьдлины волны возбуждающего симума в спектре люминесценции, % При длине волны возбуждающего излучения менее 400 нм люмиресцерция практически неразличима глазом. Как видно из табл. 2, наибольшая интенсивность люминесценции наблюдается при длине волны возбуждающего света 460-490 нм, При длине волны 490 рм люмиресцерция в 2,4 раза интенсивнее, чем при 400 рм. Дальнейшее увеличение длины волны возбуждающего света (более 490 рм) принципиально неприемлемо по следующим соображениям.Для отделения света люминесценции от возбуждающего излучения, которое попадает в поле зрения микроскопа, подобран "запирающий" светофильтр с параметрами пропускария 520-700 рм, который пропускает в, глаз наблюдателя или ра фотокатод ФЭУ только люминесцерцию (максимум на 530 рм) и полностью отсекает возбуждающий свет (максимум на 490 рм). Таким образом, максимальный параметр длины волны возбуждающего излучерия ограничен минимальным параметром пропускария запирающего" фильтра. При нарушении границызапирающего" фильтра возбуждающим светом последрий вносит искажение в свечение люминесценции.Аналогичным образом параметры самого "запирающего" светофильтра взаимосвязаны со спектром люминесценции (максимум 530 нм, правое "крыло", плавно спускаясь, доходит до 700 нм, левое - круто спадает к 500 нм), Таким образом, оптимальность параметров "запирающего" светофильтра определя1394128 Способ определения активированныхнейтрофильных лейкоцитов, включающий Составитель Г,Крюкова Редактор Г.Волкова Техред М.Моргентал Корректор О.КундрикЗаказ 2215/41 Тираж 847 11 одписное ВНИИЛИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5, Производственно-полиграфическое предприятие, г. ужгород, ул. Проектная, 4 ется задачей наиболее полного сохранения света люминесценции при максимальном удалении возбуждающего излу" чения. Нижний параметр (500 нм) определяет разделение возбуждающего света и люминесценции, верхний (700 нм) ограничен переходом видимой части спектра в инфракрасную область.10 Формула изобретения инкубацию гепаринизированной крови сраствором нитросинего тетразолия напредметном стекле, о т л и ч а ю -щ и й с я тем, что, с целью повышения точности способа, после инкубации смесь облучают монохроматическнмсветом видимой части спектра с длиной волны 460-490 нм, далее удаляютвозбуждающее излучение оранжевым све"тофильтром с пропусканием в области520-700 нм и по наличию люминесценции клеток определяют активированныенейтрофильные лецкоциты.