Камера для культивирования клеток в монослое

158Изобретение относится к устройствам для культивирования клеток и может быть использовано в экспериментальной цитологии и биохимии.Известна камера для культиврованияклеток в монослое, выполненная иэ светооптически прозрачного и нетоксичного для клеток материала и содержащая патрубок с пробкой. Камера может быть использована для пересева исслеО дуемых культур, а также для получения биомассы клеток для аналитических исследований. Для наблюдения за ростом клеток на дне камеры последнюю помещают на предметный столик 1 З инвертированного микроскопа, Так как дно камеры и ее верхняя стенка плоские и параллельные друг другу, то исключаются какие-либо оптические искажения, что позволяет качественно осуществлять прижизненный микроско. пический анализ вырашиваемых клеток: оценивать характер роста монослоя, производить морфометрические исследования, фотографировать клетки 11 д. Однако в известной камере отсутствует возможность заполнения камеры искусственной газовой смесью с минимальными потерями этого газа. Кроме того затруднено создание внутри камеры искусственной атмосферы задан ного состава без разбавления ее воздухом, содержащимся внутри камеры Это обусловлено тем, что процесс вытеснения воздуха из камеры через имеющийся патрубок, например, после33 введения в патрубок (камеру) трубки (какюли) от газометра, требует значительного объема газа, превышающего объем камеры в несколько раэ, однакс и в этом случае вытеснение остатка ф воздуха будет неполным вследствие перемешивания его с вводимым газом, и , таким образом, введенная в камеру искусственная газовая смесь будет несколько отличаться от заданной. 4 э В момент извлечения из камеры трубки (а также введения в патрубок культу" ральной среды со взвесью клеток, если таковая не быпа введена в камеру предварительно перед замещением фф воздуха камеры искусственной газовой смесью 1, возкикает дополнительное турбулентное движение смеси н воздух извне вновь попадает в камеру в не" контролируемом количестве. учитывая ээ что некоторые газы, например, содержащие метку, являются дорогими и дефицитными, то фактор непроизводительной потери газов становится весьма актуальным. Кроме того, в эксперименте могут быть использованы такие газы, попадание которых в атмосферу помещения в процессе заполнения ими камеры недопустимо (например, содержащие радиоактивную метку, облада"ющие токсическим действием и т,.п.). Цель изобретения - снижение расхо. да искусственной газовой смеси в про цессе заполнения ею камеры.Для достижения укаэанной цели камера для культивирования клеток в монослое, выполненная иэ светооптически прозрачного и нетоксичного для клеток материала и содержащаяпатрубок с пробкой, снабжена двумябессмаэочными газовыми кранами,установленными с противоположныхсторон камеры и дополнительным патрубком с проколочным элементом.На фиг. схаметично изображена камера, разрез по линии бессмаэочных газовых кранов (патрубок и доволнительный патрубок с проколочнымэлементом не изображены);. на фнг.2 -то же, разрез камеры. по линии патрубок - дополнительный .патрубок с проколочным элементом (бессмазочные газовые краны не показаны ).Камера 1 выполнена из нетоксичного для клеточных культур стекла,имеет круглую форму, плоское дио и аналогичную верхнюю стенку. Диаметрально противоположно расположены патрубок 2, герметизируемый резиновой пробкой 3 и дополнительный патрубок 4 с проколочным элементом 5. Оба патрубка соединены с полостью камеры в месте стыка верхней и боковой стенок, что исключает эатекание питательной. среды 6 в эти патруб ки при незначительном наклоне камеры в момент ее переноса, С двух других противоположных сторон камеры на уровне стыка верхней и боковойстенок вмонтированы бессмазочные газовые краны 7, расположеннйе под углом 45-50 к горизонтальной плоскости и содержащие в качествеконструктивного элемента штуцер 3 Угол 45-50 является оптимальным,так как при его уменьшении возможно эатекаиие питательной среды в конический патрубок бессмазочиых газовыхкраков,. а при приближении этогоугла к прямому затрудняются условия манипулирования кранами наэтапе заполнения камеры искусственной3 1158576 4 смесью, в особенности при вытес- для холодной стерилизации жидкоснении газом деионизированной воды,тей и газов, например миллипоровый когда камеру необходимо переворачи- фильтр. Вытесняемая искусственной вать, Кроме того, эти краны могли газовой смесью жидкость поступает бы помешать просмотру монослоя кле-через штуцер 8 противоположного бесток при помещении камеры на столик смазочного газового крана 7 и шланг, инвертированного микроскопа. соединенный с ним, в барботер, откудаБессмаэочный.газовый кран 7 выпол- может быть удален в какую-лнбо систенен в виде оснащенного штуцером 8 му и случайно вытесненный иэ камеры цилиндрического патрубка, На дисталь- О в небольшом количестве гаэ. По оконном.конце патрубок имеет отбортовку. чании вытеснения деиониэированной Конический патрубок соединяется с воды искусственной газовой смесью камерой Головка 9 крана служит . бессмазочные газовые краны 7 закрыдля перемещения внутри цилиндркческот вают и шпанг, идущий от гаэометра, го патрубка запорного штока 10 вотсоединяют от штуцера 8. В шприц дистальном отделе имеет левую резь- набирают культуральную среду со бу) с уплотнительными кольцами 1, вэвесью клеток, например, в объеме который упирается краями торца в 1 О мл и с помощью тонкой иглы ее стенки конической части патрубка 12. вводят в камеру через проколочный : На наружной поверхности цилиндрн- элемент 5.; при этом бессмаэочный ческой части патрубка находится газовый кран 7, соединенный шлангом реэьбовая муфта с разрезом к навин- через патрубок 8 с водным затвором, ченной на ней стопорной гайкой и открывают и объем газа, равный объголовкой 9 крана, Запорный шток, ему вводимой культуральной среды 6, реэьбовая муФта, стопорная гайка вытесняется из камеры. Иглу шприца к головка крана выполнены иэ биоло- нз проколочного элемента 5 удаляют гически инертного материала, напри-, к тонкое отверстие в этом элементе, мер фторопласта. герметизируется за счет эластичныхКамеру стерилизуют обычным спо- свойств резины. Бессмазочный газовый собом в автоклаве. Оба бессмазоч- кран 7 закрывают и от его штуцера нмх крана 7 закрывают, вращая 8 отсоединяют шланг, идущий к барботеЗОголовки 9, при этом запорные штоки ру (если используемая искусственная О с уплотнительньви кольцамн 11 газовая смесь в виду тех или иных упираются краями торца в конические причин должна экономно расходовать.патрубки.2, герметизкруя камеру. ся, то вытесненный из камеры через Дополнительный патрубок 4 закрывают З 5 .барботер в какое-либо устройство проволочным элементом (пробкой иэ газ может быть использован повторно эластичной резины ). Через патрубок 2 для заполнения камер). Камеру пере- камеру заполняют деиониэированной носят в термостат. Через определенные водой, послечего его закрывают .интервалы времени (часы, сутки) камеру резиновой пробкой 3. Один из бес б извлекают нз термостата и помещают смазочных газовых кранов 7 через иа предметный столик инвертированного штуцер 8 шлангом соединяют.с газо-: микроскопа, оценивая характер роста метром, содержащим искусственную монослоя 3 клеток. По окончании газовую смесь, предназначенную дляпроцесса культивирования клеток заполнения ею камеры,.а другой 4 патрубок 2 открывают, сливают культу, краи - с барботером водным эатво- ральную среду, смывают и извлекают ром), Бессмазочные газовые краны монослой клеток, после чего биомассу открывают, вращая головки 9 в про- готовят для дальнейшего анализа, тивоположную сторону, после. чего . например, с помощью масс-спектрометра, через штуцер 8 бессмаэочного газо- ф В случае применения искусственной вого крана 7 вытесняют искусствек- . газовой смеси, содержащей радиоактивной газовой смесью, подаваемой .иэ ную метку или токсичные компоненты, газометра., соединенного шлангом .с когда попадание ее в атмосферу помеэтии штуцером. В случае необходимости щения лаборатории недопустимо, камеру гаэ в камеру может быть подан ете :через штуцер 8 бессмазочного крана 7 рильным, что достигается включением, к шланг соединяют со специальным в цепь газометр-штуцер 8 бессмаэоч- . устройством, в которое выводят искусного газового крана 7,устройства ственную газовую смесь посредствомТираж 525 Государственног делам изобретений ква, Ж, РаушсПодписноекомитета СССРи открытий .я наб., д.4/5 3035, М г.ужгород, ул.Проектная,4"Патен Фили 3продувки камеры индифферентным газом в объеме, позволяющим добиться полной замены в камере искусственной газовой смеси, содержащей радиоактивную метку или токсические вещества, и только после этой процедуры камеру. вскрывают для извлечения выращенных клеток.На любом этапе культивирования клеток через проколочный элемент. 5 может быть взята проба искусственной газовой смеси и проведен ее анализ с помощью соответствующей аппара туры, например определено процентное содержание газов (с помощью газового хроматографа), наличие метки в искус ственной газовой смеси, например стабильного изотопа с помощью массспектрометра, и т,п. Аналогичным образом может быть взята проба и жидкой культуральной среды.Предлагаемая камера позволяет производить исследования влияния различных искусственных газовых смесей на культивируемые клетки с последующей оценкой их состояния по цито- логическим 1 биохимическим и другим критериям, осуществлять периодический контроль искусственной газовой смеси и культуральной среды путем отбора проб и их анализа. Камера позволяет выполнять исследования включения в метаболизм клеток метки, содержащейся в искусственной газовой смеси, а также анализировать выделение-метки в искусственную газовую смесь иэ предварительно меченых клеток или питательных сред, введенныхв камеру, Возможность вытеснениядеионизированной воды из камеры призамене ее искусственной газовойсмесью, т.е. возможность использовать искусственную газовую смесь,втаком количестве, которое требуетсятолько для заполнения камеры, позволяет использовать. наиболее дефицитные 10 и дорогие газы с минимальной их потерей.Кроме того, применение в камерепринципа замкнутого типа газообеспечения культивируемых клеток (в отличиеот проточного), позволяет предложенно- И му устройству быть полностью автономным на этапе выращивания монослоя,что обеспечивает мобильность устройства, компактность и максимальнуюпростоту его эксплуатации, Это создау 11 ет условия для проведения. экспериментальных исследований на множествепараллельных камер, когда, например,20-30 камер контрольной группы (с воздухом в качестве газовой фазы ) и такоеже количество.иэ опытной группы (с искусственной газовой смесью) послегерметизации могут быть одномоментнопомещены в один термостат, где клетки будут выращиваться в .идентичныхусловиях по температурному параметру,что, в конечном итоге, позволит достоверно оценивать полученные результаты с.применением методов математической статистики, т,е. повыситьэффективность проведения экспериментальных работ.