Способ получения антибиотика полимиксина

Л" 111195 Класс ЗОВ, 6 СССР ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕ ТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛ. Мамиоф хло ОСОБ ПОЛУЧЕН ПОЛ ИМИК. за М 57356 вий ири Совете Заявлено 26 июня 1957и откры Коиитет ио:,елаа ииистров СССРаооретенн тъпявшип льт 0 выИзобретением является способ и )- лучения антибиотика полимикспна из культуральной жидкости В. Ро 1 угпуха.Г 1 рименение предлагаемого способа позволяет получать препарат высокой эффективности при лечении долго незаживающих ран, вызванных сицегнойной палочкой.Отличительная особенность способа зак:почастся в том, что культуральную жидкость обрабатывают щавелевой кислотой, бактериальные клетки и выпавшие солц отфильтровывают, а прозрачныйфпльтрат подщелачивают едким натром, после чего антибиотик адсорбируют из раствора на катиопите КБ-П 2 и элюируют 0,35 н раствором соляной кислоты в метаноле, из которого неорганические примеси удаляют адсорбцией на катионите СБС, а содержащий антибиотик раствор или нейтрализуют на анионите ЭДЭ, упаривают и сушат для выделения твердой солянокислой соли полимиксина, или нейтрализуют триэтиламином, добавляют к полученному раствору сульфат триэтиламица в метаноле,сульфат полцмцксцца отфи р вают, промывают метанолом и суцгат в вакууме.Г 1 р и м е р 1. 90 л культуральной жидкости с яктцвпостьк 2100 сдхь определяют чашечным методом с тест-органцзмом Евс 1 тег 1 с 1 а Со 1, обрабатывают прп псрсмепцвянтп насыценных раствором цьавелевой кислоты (2,6 л) до достижения полноты осаждения кальция и рН раствора = 3,0.Выпавший Осадок Оксялятя кяль - цпя со взвесью бактсрцяльцых клеток отделяют фильтрованием, я прозрачньш цятвный раствор цейтра;изуют 10,е -цым раствором едкого натра (1,75 л) до рН 6,5 - 7,0.Прозрачный нятцвный раствор (96 . с активностью 1750 едл.) пропускают через колонку с диаметром 2,5 с.н и высотою 40 с наполненную 7 г катповитя КБ 4-П 2 в натриевой форме, со скоростью 1 ,час/г. Ионцт с адсорбпрованным на нем полцмикспном (92,3 10 в ед) промывают 2 л дистиллированной воды до достижения прозрачнойпромывной воды, а затем 70 мл метанола, после чего проводят вытеснение антибиотика 0,35 и раствором соляной кислоты в метаноле со скоростью 10 мл/часг ионита.Полученные 300 мл раствора солянокислого полимиксина в метаноле нейтрализуют анионитом ЭДЭв ОН-форме и получают 340 мл раствора активностью 16,3 104 ед/мг.Всего получают 55,4 10 ед, что составляет 60 % по отношению к полимиксину, сорбированному на ионите. С учетом элюатов более низкой концентрации зыход достигает 65/о.300 мл указанного выше раствора солянокислого полимиксина в метаноле профильтровывают через колонку с диаметром 3 см и высотою 60 см, наполненную 270 г катионита СБСв Н-форме со скоростью 2 мл/час/г катионита. Зятем кислый раствор нейтрализуют с помощью анионита ЭДЭдо рН раствора 6,5.Получают 373 мл раствора с активностью 118 10 ед/мл и 50 мл с активностью 27 10 ед/ял, Прямой выход антибиотика на стадиях обработки ионитами СБСи ЭДЭ90%. Общий выход на этих стадиях 94,8%,Сухой препарат полимиксина из метанольного раствора солянокислого полимиксина выделяют так.1. 170 мл раствора антибиотика после очистки ионитами СБСи ЭДЭс активностью 11810 ед/мл упаривают в вакууме при 35 - 40 до /4 первоначального объема; выпавший при упаривании неактивный осадок отделяют фильтрованием, после чего прозрачный концентрат упаривают в вакууме досуха.Получают 2,34 г солянокислого полимиксина с активностью 7100 ед/мг. Всего 16,610 о ед. Выход на стадии упаривания и получения сухого препарата 83 :о. Выход солянокислого полимиксина от антибиотика, сорбированного катионитом из культуральной жидкости,около 45 о/о. 2. К 200 мл раствора антибиотикас активностью 118 10" ед/лл дооазляют 2 н раствор триэтиламинсульфатя в метаноле (13,5 лл) до полноты осаждения сульфата полимиксина.Выпавшую сернокислую соль антибиотика отделяют фильтрованием,промывают метанолом до отсутствия в промывном метаноле следовхлоргидрата и сульфата триэтиламина и высушивают в вакууме прикомнатной температуре. Получают1,56 г препарата с активностью10 10 З ед/люг. Всего 15,6 10 о сд.Препарат растворяют в 30 мл дистиллированной воды, отделяютфильтрованием небольшой неактивный осадок и из прозрачного раствора добавлением 100 мл метанола осаждают сульфат полимиксиня.Последний отделяют фильтрованием и высушивают в вакууме прптемпературе не выше 45.Получают сульфата полимиксина1,52 г с активностью 10 10 ед/мг.Всего 15,2 10 о ед. Выход ня стадиивыделения сульфата полимиксина64,4%. Общий выход полимиксинаот антибиотика, сорбированного катионитом из культуральной жидкости, 36,0 о/о.П р и м е р 2. 75 л культуральнойжидкости с активностью 2300 ед/млопределяют чашечным методом стест-организмом Езспег 1 с 111 а Со 11,обрабатывают при перемешиваниинасыщенным раствором щавелевойкислоты (2,5 л) до достижения полноты осаждения кальция и рН раствора 3,0. Выпавший осадок аксалата кальция со взвесью бактериальных клеток отделяют фильтрованием, а прозрачный нативный раствор нейтрализуют 10%-ным раствором едкого натра (1,75 л) дорН 6,5 - 7,0,75 л прозрачного нативного раствора с активностью 1900 ед/млпропускают через колонку с диаметром 2,5 см и высотою 40 см, наполненную 5 г катионита КБ 4-П 2 внатриевой форме со скоростью1 лчас. В фильтрате - 65 10 о ед;сорбировяно ионитом 77 10 о ед, М 111195Ионит с адсорбированным на нем полимиксином промывают 1,8 л дистиллированной воды до достижения прозрачной промывной воды и затем 50 г метанола, после чего проводят вытеснение антибиотика 0,35 н раствором соляной кислоты в метаноле со скоростью 50 мл/чае/г ионита.Полученные 320 мл раствора солянокислого полимиксина в метаноле нейтрализуют анионитом ЭДЭ, после чего получают 350 мл раствора с активностью 15,2 104 ед/мл и общим содержанием антибиотика 53,2 106 ед, что составляет 67,2% по отношению к полимиксину, сорбированному на ионите.С учетом элюатов более низкой концечтрации выход достигает 71%. Емкость катионита по отношению к полимиксину 15,4 10 ед/г.320 мл (общая активность 48,6 106 ед) указанного выше раствора солянокислого полимиксина в метаноле профильтровывают через колонку высотою 60 слг и диаметром 3 см, наполненную 260 г катионита СБСв Н-форме со скоростью 2 лгл/час/г катионита.Получают 365 мл раствора; активность 12,7 104 ед/мл; общая активность 46,3 106 ед, Прямой выход на стадии обработки СБС95%. Общий выход с учетом слабых промывок 98,0%.Выделение сухого препарата полимиксина из метанольного раствора солянокислого полимиксина производится следующим образом.1. 200 мл кислого раствора антибиотика (общая активность 25,4 10 ед), очищенного с помощью ионита СБС, нейтрализуют до рН б,б фильтрацией через анионит ЭДЭ. Объем раствора 225 лгл. Активность 11104 ед/м.г. Общая активность 24,7 10 ед.220 мл нейтрализованного раствора солянокислого полимиксина концентрируют до 1/4 первоначального объема в вакууме при температуре 35 - 40.Выпавший при упаривании осадок отделяют фильтрованием, после чего концентрат высушивают в вакууме досуха. Получают 3,06 г солянокислогополимиксина, Активность препарата6800 ед/мг. Всего 20,810 ед, Выход на стадии получения сухогопрепарата 86% . Выход солянокислого полимиксина от антибиотика,сорбированного катионитом из культуральной жидкости, 51,0/О.2, 150 лгл кислого раствора антибиотика, полученного после очисткикатионитом СБСс активностью12,7 104 ед/лгл нейтрализуют 8 млтриэтиламина до рН 6,5. К нейтрализованному раствору добавляют12,5 мл 2 н раствора триэтиламинсульфата в метаноле до полнотыосаждения сульфата полимиксина.Выпавшую сернокислую соль антибиотика отделяют фильтрованием, промывают метанолом до отсутствия в промывном метаноле следов хлоргидрата и сульфата триэтиламина и высушивают в вакууме при комнатной температуре.Получают 1,35 г препарата сактивностью 9 10 ед/лгг. Всего12,110 б ед,Препарат растворяют в 25 мл дистиллированной воды, отделяютфильтрованием небольшой неактивный осадок и из прозрачного раствора добавлением 100 м.г метанола выделяют сульфат полимиксина.Последний отделяют фильтрованием, высушивают в вакууме при температуре не выше 45.Получают сульфата 1,3 г активностью 910 еЖмг. Всего 11,810 б ед.Выход на стадии выделения сульфата полимиксина 6,4%. Общийвыход сульфата полимиксина отантибиотика, сорбированного катионитом из культуральной жидкости 38%Предмет изобретенияСпособ получения антибиотика полимиксина из культуральной жидкости В, Ро 1 угпуха, о т л и ч а ющийся тем, что, с целью получения препарата высокой эффективности, культуральную жидкость обрабатывают щавелевой кислотой.бактериальные клетки и выпавшие соли отфильтровывают. а прозрачный фильтрат подшелачпвают ед111195 Отв. редактор И. В, Макаров Стандартгпз. Подп. к печ. 5/1 У 1958 г. Объем 0,25 п. л. Тираж 300. Цена 50 коп. Типография Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР Москва, Неглинная, 23. Зак. 1362.ким натром, после чего антибиотик адсорбируют из раствора на катионите КБ-П 2 и элюируют 0,35 н раствором соляной кислоты в метаноле, из которого неорганические примеси удаляют адсороцией на катионите СБС, а содериащий антибиотик раствор или нейтрализуют на анионите ЭДЭ, упаривают и сушат для выделения твердой солянокислой соли полимиксина, или нейтрализуют триэтиламином, добавляют к полученному раствору сульфат триэтиламина. в метаноле, выпавший сульфат полимиксина отфильтровывают, промывают метанолом и сушат в вакууме.