Способ получения стимулятора антителопродуцентов

О 1005790 СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 09 зр А.61 ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН АВТОРСКО ВИДЕТЕЛЬСТВУ(2 (2 11 Михайлова,ферова, Р,Н. Стенаев,И, Нови ев и ение приого мознтителологии и ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИИ 1) 3379265/28-132) 11 01.82(56) 1. Петров Р.В, и др. Изучроды гуморального фактора косга, стимулирующего продукциюБюллетень экспериментальноймедицины, 1978, 86, 513-51(54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТИМУ.ЛЯТОРА АНТИТЕЛОПРОДУБЕНТОВ путем выделения клеток из костного мозгаживотных с последующим инкубированиемих в питательной среде, концентрированием и элюцией , надосадочной жидкости,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, .с целью повышении выхода целевого продуктаи упрощения способа, клетки выделяют нзкостного мозга свиньи, для инкубирования.используют клетки в концентрации Э" 103 .101 на 1 мл питательной среды и инкубирование проводят в течение 1 Оч,а элюцию осуществляют нейтральной дис-тиллированной водой,(0,0 1 1005Изобретение относится к медицине вчастности к иммунологии, и может бытьиспользовано при получении костномозгового стимулятора антителопродуцентов(САП).Известен способ получения стимулятора антителопродуцентов путем выделенияклеток из костного мозга мышей с последующими инкубированием их в питательной. среде, концентрированием и элюцией 1 инадосадочной жидкости 1 )Однако известный способ является трудоемким, так как выделение клеток костного мозга и получение препарата САПосуществляют из трубчатых костей 80-ти 1мышей при помоши шприца, в результатечего повышается гибель клеток костногомозга и уменьшается выход целевого продукта (10 мг иэ 2 10 клеток),.а кроме того дпя получения САП проводят диа лиэ, который повышает вымывание частибелков, в том числе и САП.Белью изобретения является повышение выхода целевого продукта и упрощение способа.2Указанная цель достигается тем, чтосогласно способу получения стимулятора антителопродуцентов путем выделения клеток йз костного мозга животных инкубируют их в питательной среде, концент.рируют и элюируют надосадочную жидкость, . клетки выделяют.из костного мозга свиньи, для инкубирования используют клетки в концентрации.З 10 -3 10 на 1 млЬпитательной среды и инкубирование проводят в течение 10-24 ч, а элюцию осущест вляют нейтральной дистиллированной водой., П р и м е р. САП выделяют из клеток костного мозга свиньи. При разделы 790 2вании туши свиньи на мясокомбинате извлекают ребра. Изъятие ребер проводятпосле нутровки специальным приспособлением, состояйим иэ широкой длинной ручки и металлического ножа,заточенного с двух сторон, Клетки костного мозга извлекают иэ ребер путем.отжима на прессе с помошью специальной формы. После отжима и смыва питательной средой клетки костного мозга под вакуумом отсасывают из формы в стерильные флаконы. Клетки .в концентрации 3" 10 кл/мл инкубируют в среде 199 с добавлением хепес-буфера (1 М), глютамина (200 мМ) . и пенициллина (100 ед) в течение 18 ч при 37 С и культуральных фпаконах по9100-150 мл суспензии на флакон, объем которого 1 л. Надосадочную жидкость отделяют от клеток центрифугированием, концентрируют в целлофановых мешочках под вентилятором в 10 раз и наносят на колонку (Зх 100 см) с сефадексом С, уравновешенную нейтральной дистиллированной водой. Фракции элюированные в области выхода цитохрома с молекулярной массой 13000 дальтон высушивают лиофилизацией, определяют в них. количество .белка. по реакции Лоури и либо используют в эксперименте, либо хранят при 4 С,о Выход САП составляет 80-100 мг из 1 10 ядросодержаших клеток, выделен 9ных иэ одного ребра. Использование клеток в концентрации 3 10 оили 3 10 и инкубирование их в течение 10 или 24 ч приводит к аналогичному выходу препарата, Однако оптимальной концентрацией клеток является 3 10 кл/мл (табл. 1 и 2).Таблица 1+82 150+2 СО 05 ь15 120+15 . 1,5 10 5 Оценку активности САП проводят вКоэффициент стимуляции антителообракультуре ин витро и в системе ин виво зования К в обеих моделях рассчитывают по тестустимуляции антителообразования. как отношение количества .АОК, приходя 2Для определений активности САП в куль- шихся на 10 ядросодержащих клеток в6, туре ин.витро исследуемый препарат в опыте, к соответствукщему количеству дозе 50-70 мкг и в объеме 0,1 мл до- АОК в контроле.бавляют в культуру клеток лимфатическихСАП, полученный данным способом, узлов, содержащихся в 1 мл питательной Зй сохраняет все свои биологические и фнсреде в концентрации 1 10 клеток. Лим- зико-химические свойства, Он имеет мофатические узлы получают от мышей на лекулярную массу около 13000 дальтон, четвертые сутки вторичного иммунного от- в его входят рибонуклеиновая и белковая вета к эритроцитам барана. Через 20 ч компоненты. Введение его животным на культивирования определяют число анти- И пике иммунного ответа приводит к анало. телообразующих клеток (АОК) по реакции гичному увеличению количества антителоЕрне исравнивают его с числом АОК в . продуцентов,как и в известном (табл,З), контрольных культурах,Лиофнлизация препарата, используемаяпри предлагаемом способе получения, уве,Оценку активности .САП в системе ин 40 личивает срок его храненИя до двух лет. виво проводят при локальном введении. При ранее известном способе срок хране- препарата мышам на четвертые сутки вто. ния САП составлял 3 мес,ричного. иммунного ответа к эритроци- Зависимости величины эффекта стиму-. там. барана, САП в дозе 100 мкг, со- ляции антителообразования от концентрадержашихся в 0,1 мл питательной среди 45 ции клеток костного мозга свиньи н мывводят в подушечку задней конечности ши приведены в табл. 1 и 2 соответстмыши, В другую конечность, служившую венно. Сравнительная характеристика биоконтролем, вводят питательную среду. На логической активности костномозгового , следующий день у этих мышей извлекают стимулятора антителопродуцентов (САП), клетки подкопенных лимфатических узлов Ю полученного от различных видов живозъи определяют в них число АОК, сравни-ных, и активность САП при разных спо вая их количество в опыте и контроле.собах его хранения приведены в табл. 3.1005790 Клетка стногорионаогато озгарупнокота 448+49 280+46 1,6 0 САП, выделенньклеток костногомозга свиньи и 358+87 153+43( 0,05 АП свиньи лиованный после 50+78 .222+3 перия,0 0 й из о 40+39 163+18 С 0,005 П мыши посл ех месяцев хр 8224 833+236 0,9 ения и раств аемый способ епьно большее Таким позволяе траэ ме иэ бед копи черебра кта. Из однить такое,из бедренны2109 Я кл пичествкостейок ) 9ние САП Даннаяжиэнескостногого проду с.Ъставитель Г. Крюкова Редактор Н. Йжуган Техред С, Мигунова. Корректор И. Шулла-35, Раушска Зак 969/6 Тираж 7 ВНИИПИ Государс по делам йзо 113035, Москва, Жфилиал ППП "Патентф, г. Ужгород, ул. Проектна ого года храСАП, выделеннлеток костноа мыши образом, предпаг получать значи о целевого проду ньи можно выделклеток сколько0 шт. мышей (1 значительно уде ого же кох е олучевыдавливании клеток иэ ребер свипомопи пресса затрачивается в 20 ьше времени, чем при вымывании их ренных костей мышей шприцом. процедура позволяет повысить особность культивируемых клетокмозга и повысить выход целевокта (САП) до 100 мг,