Способ получения гетерогенного биокатализатора

Сеюз СеветекмнСфцмалиетмчесммнРеспублик ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(5 )М. КлВ 01 Г 37/04 В 01 Ю 37/36 В 01 7 31/06 С 12 й 11/08 с присоединением заявки М Ьеудеретееннмй кемнтет СССР до девам нэебретеннй н вткрытнй(23) ПриоритетОпубликовано 23,02,82, Бюллетень % 7 Дата опубликования описания 23.02.82(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕТЕРОГЕННОГО БИОКАТАЛИЗАТОРА в вакууме 2. 3Изобретение относится к биотехнологии, и частности к способам получения гетерогенных биокатализаторов - фермен- тов, иммобипизоввнных в нерастворимых матрицах, которые могут найти широкое применение в химической, медицинс5 кой, ттищевой и микробиологической промышленностяхИзвестен способ получения гетерогенньщбиокатализаторов - иммобилизован10 ных ферментов, путем присоединения протеолитических ферментов к полимерам ковалентными, ионными и координационными связями 1 1.Однако прн этом не достигается доста-, точно высокой стабильности гетерогенного биокаталиэатора.Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому является способ получения гю. терогенного биокатвлизатора для гидролвза пептидов в растворе с 1, -аминокислот путем растворения Протосубтилина в водном растворе фосфвтного буфера сополтемера стирола и малеиновой кислоты споследующим добавлением водного рвсчвора хлорида хрома (И 1), промываниемобразовавшегося хромсодержащего комплекса Протосубтилина с сополимером стирола и малеиновой кислоты и сушкой его Недостатком этого способа является невысокая стабильность гетерогенного биокатализатора к действию раствора смеси 0(.-аминокислот, которые являются конкурентными лигандами и способны разрушать металлосодержаший комплекс фермента с сополимером стирола и малеиновой кислоты. При контакте с раствором К -аминокислот уменьшается ферментативная активность нммобилизованного фермента и в раствор са.-аминокислот с носителя десорбируется фермент, это приводит к уменьшению срока службы гетерогенного биокатализатора (5 сут) и загрязнению получаемого целевого продук- та десорбирующим с носителя ферментом90660 20% от содержания белка в биокатализаторв),Цель изобретения - получение биокатализатора с повышенной стабильностью,Поставленная цель достигается тем, 5что согласно способу получения гетерогенного биокатализатора для гидролизапептидов путем растворения Протосубтилина в водном растворе фосфатного буферасополимера стирола и малеиновой кисло Оты с последующим добавлением водногораствора хлорида хрома (111), промыванием образовавшегося хромсодержащегокомплекса Протосубтилина с .сополимером стирола и малеиновой кислоты , высу 45шенный хромсодержащий комплекс суспендируют в ацетоновом растворе фтороплаота и формуют пленку или волокно,Преимущество предлагаемого изобретения заключается в получении биокатали 2 рзатора с повышенной стабильностью. Впроцессе его эксплуатации активность вреакции гидролиза пептидов в раствореД, -аминокислот при нагреве при 37 оСв фосфатном буфере рН=7,4 и модуле ван ны 200 составляет по истечении 15 сут60% от исходной, тогда как биокатализатор по известному способу на седьмыесутки полностью утрачивает свою активность, 30Высокая активность катализатора попредлагаемому изобретению сопровождается высокой стабильностью хромсодержащего комплекса в водном растворе с(, -аминокислот. Так, количество белка, десорбиро 35вавшегося в 5%-ный раствор смесио 1.-аминокислот составляет только 2% отсодержания белка в биокатализаторе (длябиокатализатора по известному способу(2 - 20%) .П р и м е р 1, В 140 мл 2%-ногораствора сополимера стирола и малеиновой кислоты в 0,25 М фосфатном буферерастворяют при комнатной температуре3 г Протосубтилина, После растворениядобавляют водный раствор хлористогохрома (П 1) в количестве, обеспечивающемобразование 1 М раствора. Образовавшийся осадок тщательно промывают водой и высушивают в вакууме при комнатной температуре,К 100 мл 14 Ь-ного раствора фторс-,пласта 42 в ацетоне при перемешивании(600 об/мин) прибавляют 1,106 г высушенного и размолотого (размер частиц5550-100 мкм) хромсодержащего комплекса Протосубтилина ГЗХ (Сг -1 вес,),с сополимером стирола и малеиновойкислоты, полученного ло известному спо 2собу, Полученную суспензию перемешивают еще 30 мин и формуют пленки по сухому способу. Эффективность иммобилизации - 21, фермент не аесорбируется припромывках 0,2 М фосфатным буферомрН 7,4.)П р и м е р 2. К 100 мл 14-ногораствора фторопластав ацетоне при перемешивании (600 об/мин) прибавляют.0,553 г лиофильно высушенного и размолотого хромсодержащего комплекса Протосубтилина ГЗХ (С" 1 вес. %) с сополимером стирола и малеиновой кислоты,полученного по описанному в прймере 1способу, Полученную суспензию перемешивают 30 мин, обезвоздушивают в течение 1 ч и формуют волокно в водно-ацетоновую ванну (соотношение ацетонвода 95:5), Волокно вытягивают на воздухе в два раза, высушивают и затемвытягивают на 500 в глицерине прио140 С. Полученное волокно промываютот глицерина водой и сушат. Эффективность иммобилизации составляет 40%.Была изучена стабильность исходногохромсодержащего комплекса протеолитического фермента с сополимером стирола и малеиновой кислоты и биокатализаторов, полученных по предлагаемомуспособу, к:действию 5%-ного раг- ., асмеси 18 Й аминокислот эквимолекулярные количества аланина, глицина, серина,треонина, глутаминовой и аспарагиновойкислот, пролина, валина, метионина, цистеина,лейцина, изолейцина, фенилаланина,тирозина, триптофана, гистидина, лизина иаргинина) при 4 С и модуле ванны 40 (впересчете на иммобилизова нный фермент).При этом определялосы изменение активности обоих гетерогенных биокатализаторов и десорбция из них белка (табл. 1и 2). Была изучена также термостабильность указанных биокатализаторов(табл. 3) при 37 С и рН=7,4 (0,2 Мфосфатный буфер, модуль ванны 200).Полученные по предлагаемому способу биокатализаторы в отличие от исходных металлосодержащих комплексов протеологического фермента с сополимером стирола и маленковой кислотымогут быть использованы не только ваппаратах с перемешиванием периодического действия, но и в аппаратах колоночного типа.Биокатализатор испытывался на установке проточного типа и показал стабильную активность для полного гилролиза пептидов в растворе смеси с(.-аминокислот в течение 10 пней,,Т а б л и ц а 1 Известный 19 0 0 0 Предлагаемый 84 72 64 60 66 61 Т а б л и и а 2 2 2 0 9 Известный Предлагае,7 2 2 вестный 4 редлагаей 100 0 8 6 я повораоб 50 сушс я, елиф 55 формула изобретениСпособ получения гетерогенного б катализатора для гидролиза пептидов тем растворения Протосубтилина в во ном растворе фосфатного буфера соп ра стирола и малеиновой кислоты с следующим добавлением водного раст хлорида хрома .(111), промыванием разовавшегося хромсодержашего комплекса Протосубтилина с сополимером стирола и малеиновой кислоты и его кой в вакууме, о т л и ч а ю ш и й тем, что, с целью получения биокат затора с повышенной стабильностью, сушенный хромсодержаший комплекс даруют в ацетоновом ,растворе фтоста и формуют пленку ипи волокно,Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Иммобилиэованные ферменты.Под ред. Березина И.В., Антонова В,К. и Мартинека К. МГУ, 1976, т. 1, с. 12. Слободяникова Л.С., Латов В.К. и Беликов В.М. Иммобилизация протеаз ВОС 1 КОа 5 ОЫлЬ 5 на сополимере стирола с малеиновым ангидридом ковалент ными и координационными связями.Прикладная биохимия и микробиология".1979, т. 15, с. 262 (прототип).