Способ перфузии растительных клетоки устройство для его осуществления

Сфеэ Сфветскнх Соцнапистичесних РеспубликОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ иц 81283 О(5)М. Кл.з С 12 К 1/10 Государственный комитет СССР яо яеааи изобретений и. открытий.Дата опубликования описания 150381(72 Авторы изобретения А.В.Плакс и В.М.Юрин Институт экспериментальной ботаники им.В,Ф.Купревйча АН Белорусской ССР(54) СПОСОБ ПЕРФУЗИИ РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯИзобретение относится к биологии и применяется при исследовании физикохимичвских свойств биологических мем-. бран.5Известен способ перфузии клеток путем пропускания искусственного клеточного сока через торцы клетки, причем концы клетки отрезают, вводят в них канюли, через которые пропуска" ют искусственный вакуолярный сок.Устройство для осуществления этого способа содержит камеру для закрепления клетки, микрошланг, соединенный с микроворонкой и канал для .выведения сока из клетки. микрошланг 15 вставляют в канюлю, закрепленную в клетке, и через воронку подают искусственный вакуолярный сок. Вытекание сока происходит через второй отрезанный конец клетки 11) . 20Недостатком известного способа и устройства для его осуществления является снижение жизнеспособности клетки вследствие ее повреждения и значительного снижения давления внутри клетки. Перфуэированные таким образом клетки сохраняют жизнеспособность лишь 1,5-2 ч. Исследуемые физико-химические характеристики изменяются в процессе перфузии. Кроме того, 30 при снижении давления в клетке невозможно снимать электрические характеристики между цитоплазмой и наружной средой, поскольку клетка харовой водоросли представляет собою цилиндр, пристенный слой которой толщиной 10- 15 мкм представлен цитоплазмой, а остальную часть (90 объема) занимает вакуоль; мембрана, прилегающая к .оболочке, называется плаэмалеммой, вакуоль от цитоплазмы отделяется второй мембраной - тонопластом. При пер фузии происходит замена именно вакуолярного сока, Если же концы клетки отрезают, то давление цитоплаэмы и давление внутри вакуоли резко падает, н наружная мембрана - плазмалеммаопадает, смыкаясь с внутренней " тонопластом. В таких случаях невозможно с помощью микроэлектродной техники снять электрические характеристики между цитоплаэмой и наружной средой, т.е, плазмалеммы. Цель изобретения - сохранение жизнеспособности клеток в течение естественного времени их жизни, снижение травматичности клеток и поддержания в ннх естественного внутри- клеточного давления.Формула изобретения Ы1Способ перфуэии растительных клеток путем пропускания искусственноговакуолярного сока через торцы клетки,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью сохранения жизнеспособности 60 клеток в течение естественного времени их жизни; торцы клеток прокалываютмикроиглами, через которые осуществляют перфузию.2. Устройство для осуществления 6 способа по п.1, включающее камеру для Поставленная цель достигается тем,что торцы клеток прокалывают микроиглами, через которые осуществляютперфузию, при этом выход канала длявведения в клетку искусственного вакуолярного сока снабжен микроиглой, амикроигла на входе канала для вывода сока из клетки снабжена подвижным в продольном направлении конусо-,образным стержнем, соединенным черезпружину с тросиком. 0На чертеже изображена схема устройства для осуществления предложенногоспособа,Канал для введения в клетку искусственного вакуолярного сока содержитшприц 1, Который через микрошланг 2соединен с микроиглой 3. Микрошланг2 снабжен манометром 4, микрокраном5 и демпфером б, Канал для вывода сока из клетки содержит шприц 7, которыйчерез микрошланг 8, снабженный мано- Юметром 9 и микрокраном 10, соединен смикроиглой 11, во внутренней полостикоторой подвижно в продольном направлении установлен конусообразный стержень 12, соединенный с тросиком 13,через пружину 14. В камере 15 закреплена исследуемая клетка 16.,Предложенный способ осуществляетсяследующим образом,Клетку водоросли 16,укрепляют в- ЗОкамере 15. Шприц 1 заполняют искусственным вакуолярным соком, Гидростатическое давление в шприце 1 устанавливают 6-7 атм (равное естественномувнутриклеточному давлению), послечего торец клетки прокалывают микроиглой 3, предназначенной для подачиперфуэата (искусственного вакуоляр"ного сока) . Давление в шприце 7 устанавливают такое же, как и в шприце 1,и прокалывают другой торец клетки мик роиглой 11, предназначенной для вытекания сока. Затем давление в шприце1 повышают и производят замену внутриклеточного сока.Устройство для осуществления предложенного способа работает следующимобразом.Шприцы 1 и 7 заполняются искусственный вакуолярным соком, который заполняет также микрошланги 2 и 8 и мик-рроиглы 3 и 11,после чего микрокраны 5и 10 перекрываются, причем микрошланги 2 и 8 заполняются соком таким образом, что в них остается по пузырькувоздуха.После этого микроигла 3 вводитсяв торец клетки, давление в шприце1 устанавливается 6-7 атм и микрокран 5 открывается. При этом пузырек воздуха в микрошланге 2 передвигается либо вверх, либо вниз, взависимости от разности давлений вклетке 16 и шприце 1, Изменением давления в шприце 1 движение пузырькавоздуха останавливается, что означает выравнивание давлений в клетке 16 и шпРице 1, После этого в шприце 7 устанавливается такое же давление как и в шприце 1 (его показывает манометр 4) .-Это естественное гидростатическое давление данной клетки. Стержень 12 с помощью пружины 14 плотно закупоривает входное отверстие микроиглы 11. При таком положении стержня 12 микроигла 11 вводится в другой торец клетки. После этого открывается микрокран 10, а стержень 12 с помощью тросика 13 оттягивается и открывает входное отверстие микроиглы 11. Далее в шприце 7 все время поддерживается постоянное давление, равное внутриклеточному, а в шприце 1 давление повышается до 8-10 атм в зависимости от необходимой в данном эксперименте скорости перфузииСопротивление демпфера 6 подбирается также в зависимости от необходимой скорости протекания искусственного сока через клетку. Скорость же перфузии определяется с помощью пузырька воздуха, движущегося под давлением в калиброванном микрошланге 2, и секундомера при известности диаметра микро- шланга 2 и внутреннего объема клетки. При необходимости увеличить или уменьшить скорость перфузии увеличивается либо уменьшается давление в шприце 1. Демпфер 6 сбрасывает разность давления между шприцами,и давление в микро- игле 3 равно внутриклеточному.Таким образом, предложенный способ перфузии растительных клеток и устройство для его осуществления позволяют сохранить жизнесцособность клетки в процессе перфузии за счет значительного снижения травматичности клетки и поддержания ее естественного давления. Это позволяет снимать в процессе перфузии физико-химические характеристики нормально Функционирующей клетки, а также измерять дополнительные параметры, например физико-химические характеристики между цитоплазмой и наружной средой. Таким образом, как и на интактной естественной) клетке, возможно регйстрировать электрические параметры каждой мембраны - плазмалеммы и тонопласта - в отдельности.812830 Составитель В.АлексеевТехредЖ.Кастелевич Коррект абине ко тор И.Недо Ред писн митетаоткрытиская на 4/5 филиал ППП фПатент, г.ужгород, ул.Проектна закрепления исследуемой клетки, каналы для введения и выделения искусственного вакуолярного сока, о т л ич а ю ц е е с я тем, что, с целью снижения травматичности клеток и поддержания в них естественного внутриклеточного давления, выход канала длявведения в клетку искусственного ва-куоляриого сока снабжен микроиглой, амикроигла на входе канала для вывода.,сока из клетки снабжена подвижным в10продольном направленииконусообразным 99/31 Тир ВНИИПИ Государственного ко по делам изобретений и 113035, Москва, Ж, Раушстержнем, соединенным через пружинус тросиком,Источники информации,принятые во внимание при экспертизе 1. Верестовский,Г.И. Методические особенности внутриклеточной перфузии и Фиксации напряжения на клетках И 1 еТ 1 орв 1 в оЬцва. Харовые водоросли и их использование в исследовании биологических процессов клетки. Сборник, 1973, с,243-259,