Способ получения вещества, стимулирующего созревание т лимфоцитов

Союз СоветскихСоциалистических республик 06 О 89 КОМУ СВИ) Дополнительное к а свил-ву 11. 07,7 8(21) 26 43 199/28-1 3 22 Зая. К 61 2 аявки М с присоединение атвуда 3) П рноритет Опубликован Дата опубл елам взебретеннх и етхрытнв о 30.12.79, Бюллетень М 4 икования описания 04.01.80 15.45;088,8 )(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕЩЕСТВА, СТИМУЛИРУЮ СОЗРЕВАНИЕ Т ЧИМфОЦИТОВИзобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касает ся получения биологически-активных. препаратов для лечения и диагностики иммунодефицитных состояний.Известен способ получения вещества, стимулирующего созревания Т пимфоцитов, путем дефибринированияплазиы сыворотки, диализа против солевого буферного раствора, хроматографии на сефадексе б - 25, затем нв карбоксиметилцеллюлозе, обработки активиниро ввйным углем. тонкослойной хромвто графин в системе бутанол- пиридин и выделением целевого продукта электрофорезом 11. али яе ает ег произоще Однако известный способ явтрудоемким, требует большогочества сыворотки,что ограничпроизводительность и удорожаводство препарата,Целью изобретения являетсние технологического процесса Эта цель достигается тем; что тканьтимуса крупного, рогатого скотаизмельчают, диализуют против воды в течение29-24 ч, диалиэат хроматографируют наиммобилизированном эуглобулине пригионной силе 0,14 - 0,15 и элюируютцелевой продукт водой,П р н м е р, 0,5 кг тимуса теленкагомогенизируют в 0,14 М МОСЕ1;2 вес./объем) и,ди зуют против5,0 - 10, 0 объемовдистиллированнойводы в течение 24 ч. В диализат добавляют рвсчитанное количество Мс 1 Сс,чтобы его конечная молярная концентрация достигла значения 0,14, рН днвлизатв доводят до 7,2 - 7,5 добавлениембикарбоната натрия, Диализат пропускаютчерез колонку, содержащую иммобилизированный эуглобулцн быка или ннкубируютс сорбентом, суспендированным в дивлио оэате в течение 5 - 8 ч при 4 С 4 Э,5 С,Затем сорбент открывают в колонке (илина воронке Бюхнера) 0,14 М Мс 1 Сс,эабуферненным бикарбонатом натрия, под706089 3 Число наблюдений Число розеткообразующих клеток Испытуемыесыворотки 550 Контроль А нтилимфоцитарнаясыворотка ФСД 50 мкг ФСД с антилимфоцитарной сывороткой 352 Таблица 2 2414,530 3 6 4 контролем спектрофотометра (до экстинкции в промывных водах (при 260 - 280 нм не более О, 001). Сорбировав- шийся фактор элюируют дистиллированной водой и лиофилизируют, В случае применения колоночного метода выход фактора контролируется с помощью спектрофотометра. Злюированную фракцию лифилизируют, В случае применения воронки сорбент выдерживают в течение 2 ч в двух обьемах дистиллированной воды, отделяют фильтрованием и лиофилизируют.Приготовление сорбента.Сыворотку быка диализуют против 10-кратного обьема дистиллированной воды в течение 48 ч. Выпавшие в осадок сывороточные эуглобулины отделяют фильтрованием, Осадок растворяют в минимальном, объеме 0,14 М Мдф забуференном 0,01 м концентрацией бикар-, бонатного буфера рН 7,5. 30 мл растВлияние фактора тимуса, выделенно го методом аффинной хроматографии, на количество розеткообразующих клеток в вора эуглобулииов с коицитр;шией белка 80,0-20,0 мгlмл инкубируют с 5 мл набухшей целлюлозы, се,чдекса или сефарозы, активированиой Б СМ известным способом, Инкубацию проводят при рН 9,5.Определение активности осуществляется известным способом по увеличению чувствительности розеткообразующих лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей к антилимфоцитарной сыворотке или азотиоприну.10 лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей инкубируется с 50, 0 мкг лиофилизированного препарата (по сухому весу), после чего испытывается чувствительность розеток, образуемых этими клетками с эритроцитами барана, к антилимфоцитарной сыворотке.В табл. 1 приведены результаты испытания фактора, стимулирующего дифференцировку Т-лимфоцитов (ФСД).Таблица 1 составе лимфоцитов крови больных опухолями ЛОР органов показано в табл 2,Продолжение табл. 2 1Количество розеткообразуюшихКоличество розеткообразуюших лимфо т цитов крови больных опухолями ЛОР органов, %, после инкубации с исследуемым фактором лимфоцитов крови больных опухолями ЛОР органов, % Концентрация1 мкг 10 мкг 100 мкг 20 21 21 26 22 48 17 Составитель С. Малютина Редактор Г, Прусова Техред Н; Ковалем Корректор О, КовинскаяЗаказ 8110/3 Тираж 672 ПодписноеШ 1 ИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская набд. 4/4/54 Филиал ППП "Патент, г. Ужгород, ул. Проектная,Предлагаемый способ получения препрепврвтв тимусв, стимулирующего созрео ванне Т-лимфоцитов, позволяет выделить фактор с помощью одной хроматографической процедуры, не требующей применения колонок, из любого количества исходного материала; предусматривает атюцию конечного продукта водой,.что избавляет от необходимости очистки ко-нечного продукта от солей и тем самым удешевляет его наработку,30Для выделения фактора по методу Баха требуется 10 препаративных приемов, а по предлагаемому способу -3, и диагностики иммунодефицитных состояний. Формула изобретенияСпособ получения вещества, стимулирующего созревания. Т лимфоцитов, путемдиализа животного сырья и хроматвграфии,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,-сцелью упрощения технологического процесса, тканьтимусв крупного рогатого,скота измельчают, диализуют против воды в течение 20 - 24 ч, диализат хроматографируют на иммобилизированномэуглобулине при иЬнной силе 0,14 -0,15 и элюируют целевой продукт водой.Источнйки информации,принятые во внимание при экспертизе1. Патент франции М 2265404,А 61 К 37/24, опублик. 1977 (прототип).