Способ получения калликреинтрипсин-ингибитора

п 11 5035 И Союз Советских Социалистических Республик23) Приоритет31) Р 2116377.9 Государственный камнте вета Министров ССо делам изобретени 53) УДК 615 779 9(088.8) ликовано 15.02.7 тхрыт Дата опубликован 2) Авторы изобретения Иностранцы х Рауенбуш и Кристиан(ФРГ) Иностранная фирма Байер АГ(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯИКРЕИН-ТРИПСИН-ИНГИБИТОР 2 ольшое знамеризаторы лысой вну тпе ос щестзначении рН ции ингибпраствором. Изобретение относится к медицинской промышленности, а именно к получению лекарственных препаратов.Известен способ получения калликреинтрипсин-ингибитора, заключающийся в том, что органы крупного рогатого скота, например легкие, измельчают и после экстракции целевой продукт осаждают кислотами, например сульфосалициловой кислотой, с последующей кристаллизацией целевого продукта после его обессоливания. Однако известный способ является трудоемким,С целью упрощения процесса экстракт подкисляют до рН 1,0 - ,3,0, вводят в него соли, например сульфат аммония в концентрации- 400 г/л, подвергают контакту с нейтральным нерастворимым в воде сшитым полимером пористой структуры из стирола и дивинилбензола с активной поверхностью 10 - 1000 м/г, последовательно промывают полимер водой или разбавленной соляной кислотой и раствором соли этилендиаминотетрауксусной кислоты, элюируют целевой продукт градиентом воды и смешивающегося с водой органического растворителя,Для осуществления способа существенным является качество сырого экстракта. Для этого орган, например легкое или околоушную слюнную железу, обрабатывают путем метанольнои экстракции и метанол затем снова полностью удаляют из экстракта. Сферическая активность составляет 70 - 90 единиц калликреин-ингибитора на 1 мг сухого веса.5 Если переведение в растворимую формосуществляют путем добавления карбоновой или минеральной кислоты, то после осветления адсорбция ингибитора на смоле является неполной, но ее можно улучшить посредст О вом предварительной обработки сырого экстракта, например, путем добавления таких солей, как, например, сульфат аммония, или переведение в растворимую форму осуществля 1 от в присутствии сульфата аммония. Адсорб ция улучшается вследствие повышающейсяконцентрации соли, причем как верхний предел концентрация начинающегося осаждения ингибитора не должна быть превышена. Для сульфата аммония таким пределом является 2 О насыщенность 0,2 - 0,5 при значении рН 1 - 2,5. Своиство смолы также имеет бчение, применяют пористые полиз стирола и дивинилбензола с б5 ренней поверхностью.Адсорбцию ингибитора на смовляют из кислого раствора при1 - 3. После проведенной адсорбтора смолу промывают воднымНаряду с чистой водой применяют и 0,01 М соляную кислоту и затем 0,02 М раствор натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты. При этом удаляют примеси. Вымывание ингибитора из смолы осуществляют органическими, смешиваемыми с водой раствори телями, например метанолом, этанолом, изопропанолом, ацетоном.Концентрация, при которой вымывают калликреин-трипсин-ингибитор, зависит от вида растворителя, Добавки к растворителю могут изменить процесс десорбцин, Так, например, добавка аммиака содействует ускорению вымывания, причем вымываются и красящие компоненты. Полученный таким образом калликреин-трипсин-ингибитор как показал электрофорез в полиакриламиде или на ацетилцеллюлозе, в значительной степени свободен от других сопутствующих полипептидов и солей. Специфическая активность составляет 3000 в 40 единиц калликреин-ингибитора на 1 мг сухого веса. Выход составляет 60 - 80/ содержания ингибитора сырого экстракта при обогащении в 30 - 40 раз.При мер 1. 700 г легкого крупного рогатого скота, освобожденного от соединительной ткани и измельченного, переводят в растворимую форму метанолом при добавке хлорида кальция. Суспензию отделяют центрифугированием и в вакууме в ротационном испарителе сгущают до 275 мл. Метанол полностью удаляют. Значение рН раствора 1,5 устанавливают, добавляя 2 н. соляную кислоту, затем снова центрифугируют. Отделившийся сверху слой содержит 880000 единиц калликреин-ингибитора. Этот раствор вводят в следующую колонну.50 г пористой полистирольной смолы с поверхностью 330 м/г поглощают в метаноле и до тех пор промывают, пока метанол не станет практически свободен от адсорбируемых при ультрафиолетовом облучении (280 нм) веществ. Затем метанол декантируют н заменяют кипяченой дистиллированной водой, Водную суспензию смолы (примерно 100 мл), свободную от пузырей, вводят в стеклянную колонну и промывают 200 мл воды.Содержащий ингибитор сырой экстракт вводят в колонну с пропускной скоростью 100 мл/ч, промывают 200 мл 0,01 М соляной кислоты и затем 200 мл натриевой соли 0,02 М этилендиаминтетрауксусной кислоты и 100 мл воды. Ингибитор при этом с линейным градиентом 1 л воды к 80% метанола вымывают и фракционированно улавливают. Содержащую ингибитор фракцию объединяют, метанол выпаривают в вакууме и водный раствор подвергают сублимационной сушке. Получают 180 мг ингибитора с 714 единицами калликреин-ингибитора, что составляет 81/ содержания ингибитора. Специфическая активность составляет 3960 единиц калликреин-ингибитора на 1 мг.Пример 2. 4 кг измельченного легкого крупного рогатого скота смешивают с 7,2 л 5 1 О 1 й 20 25 30 зд 40 Я 5 55 60 Дг дистиллированной воды, По истечении 10 мин размешивания добавляют 350 мл 1 О/с-ной (по объему) Н 504 до установления значения рН 1,9. Дополняют до 12 л, дополняют 200 мл толуола и размешивают в течение ночи при комнатной температуре. Суспензию центрифугнруют в течение 10 мин при 4800 об/мин. Общая активность в отстоявшемся наверху слое 8,15 КО единиц калликреин-ингибитора. Размешивая в течение 30 мин, добавляют (МН,)50 до насыщения 0,45. Значение рН посредством добавки концентрированной Нг 504 устанавливают на 1,5, в качестве фильтров ального вспомогательного вещества добавляют 320 г кизельгура и немедленно фильтруют.7 л этого раствора (общая активность 4,38 К 10 единиц) калликреин-ингибитора вводят в колонну примерно с 2 л пористой пол истирольной смолы с поверхностью 150 м/г. Перед этим кислоту промывают 1 н. метанольным НС, метанолом и водой. После введения экстракта колонну промывают 4 л 0,01 и, НС 1, 4 л 0,02 ЕДТА (патриевая соль этилендиаминотетрауксусной кислоты) и 2 л дистиллированной воды, затем вымывают линеарным градиентом, состояющим из 5 л дистиллированной воды и 5 л 80/о-ного метанола. Активные фракции объединяют, метанол отгоняют в вакууме и раствор лиофилизируют. Получают 1,3 г вещества со специфической активностью 2500 единиц калликреин-ингибитора на 1 мг (общая активность 3,22(10 единиц калликреин-ингибитора), что соответствует выходу 73,5/о.П р и м е р 3. 120 кг легкого крупного рогатого скота метанолом при добавке хлорида кальция согласно примеру 1 переводят в растворимую форму. Из 400 л полученного прозрачного фильтрата метанол тщательно отгоняют. Водный раствор, содержащий калликреин-трипсин-ингибитор в сыром виде, подкисляют НС до значения рН 1,5 и вводят в колонну с 8 л пористой полистирольной смолы с поверхностью 150 м/г. Общая активность 152(10 единиц калликреин-ингнбитора. Колонну промывают 16 л 0,01 н. НС 1, 16 л 0,02 М ЕДТА и 10 л дистиллированной воды. Затем активное вещество вымывают линеарным градиентом из 20 л дистиллированной воды и20 л 80/-ного метанола. Фракции, содержащие активное вещество, объединяют, метанол отгоняют и раствор лиофилизируют. Получают 25,7 г твердого вещества со специфической активностью 4200 единиц калликреин-ингибитора на 1 мг (общая активность 1 ОХ 10 единиц калликреин-ингибитора), что соответствует выходу 71/Пример 4. 120 л легкого крупного рогатого скота, переведенного согласно примеру 1 с метанолом - хлоридом кальция в растворимую форму, после удаления метанола, установления значения рН 1,5 и центрифугирования дали 67 мл отделившегося сверху слоя с 50000 единицами калликреин-ингибитора. В503511 Составитель С. МалютинаТехред 3. Тараненко Редактор Е. Хори на Корректор О. Тюрина Заказ 90613 Изд. Хз 1116 Тираж 575 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Типография, пр, Сапунова, 2 этот сырой раствор ингибитора вводят 10 мл пористой полистирольной смолы. После 30 мин на нутч-фильтре смолу отсасывают и промывают 100 мл воды, Затем смолу суспендируют и в течение 30 мин размешивают в растворе 20 мл изопропанола, дополненного водой до 100 мл, Смолу отсасывают и в филь- трате после отгонки изопропанола в вакууме определяют ингибитор. Выход 123 единиц калликреин-ингибитора, что составляет 807 о имевшегося содержания ингибитора.Формула изобретенияСгюсоб получения калликреин-трипсин-ингибитора путем селективного выделения из сырого экстракта органов крупного рогатого скота, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, экстракт подкисляют до рН 10 - 30, вводят в него соли, например 5 сульфат аммония, в концентрации 1 - 400 г/л,подвергают контакту с нейтральным нерастворимым в воде сшитым полимером пористой структуры из стирола и дивинилбензола с активной поверхностью 10 - 1000 мЧг, после довательно промывают полимер водой илиразбавленной соляной кислотой и раствором соли этилендиаминотетрауксусной кислоты, элюируют целевой продукт градиентом воды и смешпвающегося с водой органического ра створителя.