Способ получения -лизипа

266649 О П И С А Н И ЕИЗОБРЕТЕНИЯК ПАТЕНТУ Союз СоветскизСоциалистическими Республик висимый от патента Заявлено 10,1 Х.1966 ( 1100755/28-13)Приоритет: 11.1 Х.1965 ( 55376-65, Япония)Опубликовано 17.111.1970. Бюллетень11Дата опубликования описания 6 Х 111,1970 Кл, 6 Ь, 16/03 12 п, 6/01 МПК С 124 С 071Ком о лелагл ний и открытийете МинистровСССР изоб ДК 663.18:576.8.097.35 (088.8) Пр Авторы зобретени Иностранцы цунобу Танака и Казуо Кимураявитель Иностранная фирма Кийова Хакко Когио Ко, ЛИЗИНА СПОСОБ ПОЛУЧЕНИ Известен способ получения 1-лизина путем выращивания продуцирующих его микроорганизмов на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода углеводородные фракции нефти, в присутствии необходимых 1 для роста минеральных солей и стимуляторов роста с последующим выделением 1-лизина из культуральной жидкости одним из известных способов, например при помощи ионообменных смол,Предлагаемый способ позволяет увеличить выход 1-лизина.Для этого в качестве продуцентов используют штамм Аг 1 ЬгоЬасег рагайпецз (АТСС 21003), требующий для своего развития гомосерин, а также штаммы ВгечЬасФег 1 цгп Ке 1 од 1 ц 1 агп 1 сцтп (АТСС 21004) и СогупеЬас 1 ег 1 цтп Ьус 1 госагЬос 1 аз(цз (АТСС 2/131), требующие для своего развития метионин и треонин.Способ получения 1-лизина заключается в том, что продуцирующие его микроорганизмы, такие как АгйгоЬас 1 ег рагайпецз (АТСС 21003), требующий для своего роста гемосерин, ВгеиЬас 1 егшгп 1 се 1 од 1 ц 1 апт 1 сшп (АТСС 21004) или СогупеЬас 1 егштп ЬудгосагЬос 1 аз 1 цз (АТСС 2/131), требующие для своего развития метионин и треонин, выращивают на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода углеводородные фракции нефти, источники азота, неорганические соли и стимуляторы роста. Культивирование производят в аэробных условиях при температуре 5 от 20 до 40 С и рН среды, равном от 4,0 до9,0.В качестве углеводородных фракций нефтииспользуют н-парафины, содержащие от 10 до 30 атомов углерода в количестве от 1 до 10 30%, можно использовать единичные илисмесь нескольких н-парафинов, таких как я-додексан, н-тридекан, н-тетрадекан, н-пентадекан, н-гептодекан, а также смесь, последних с другими источниками углерода. В каче стве углевода могут быть использованы глюкоза, меласса, в небольшом количестве гидролизат крахмала.В качестве источника азота используют соли аммония: сульфат аммония, нитрат аммо ния, хлорид аммония,:карбонат аммония. Неорганические соли используют такие, как фосфат калия, сульфат магния, сульфат марганца, хлорид калия, сульфат железа. В качестве стимуляторов роста применяют мясной экс тракт, дрожжевой экстракт и др.После окончания процесса ферментации1-лизин выделяют из культуральной жидкости одним из известных способов, например экс3тракцией или центрифугированием, при помощи ионнообменных смол.П р и м е р. Микроорганизм, требующий гомосерин, ВгечЬасег 1 цгп 1 е 1 од 1 ц 1 аппсцз Ко 2439 АТСС 15587 выращивали в двухлитровой конической колбе на питательной среде, содержащей 10/о дрожжевого экстракта, 1/О мясного экстракта, 1% пептона и 0,20/, ХаС 1 в аэрооных условиях при температуре 30 С в течение 24 час, Затем выращенную таким об,разом культуру (маточную) в количестве 10% пересеяли в пятилитровый ферментер, содержащий 3 л питательной среды, состоящей из 10% и-,парафинов, содержащих от 12 до 18 атомов углерода, 0,10/, КН РО 4, 0,1% КНРО 4, 0,1 о/о Мд 504 7 НО; 0,0020/о Мд 804 4 НО;0,020/, Ре 504 7 НО; 100 у/л хлоргидрата тиамина; 100 у/мл гомосерина и 2% (КН,).804, рН среды равен 6,5,Культивирование осуществляли при температуре 30 С в аэробных условиях при перемешивании в течение 72 час. При этом в культуральной жидкости образовалось 10 мг/мл /-лизина.Затем из культуральной жидкости удалили клетки путем ее центрифугирования, Фугат пропустили через ионообменную смолу Амберлит 1 К 1-50. рН раствора поддерживали на уровне 7,0 при помощи 0,5 М буферного раствора, Колонку со смолой промывали водой и 0,15 И раствором аммиака, Фракции, дающие положительные реакции на нингидрин, собрали и посредством аэрации удалили из них аммиак. рН раствора, полученного таким образом, довели до 2,0 6 Х соляной кислотой (НС 1), далее при пониженном давлении раствор сконцентрировали, В полученное вещество добавили немного воды и спирта и получили 20 г сырых кристаллов гидрохлорида 1-лизин.Характеристика штаммов, продуцирующих 1-лизин.1. АгйгоЬас 1 ег рагаЫаецз.Выделен из почвы.Морфология. Короткие палочки, разветвленные, изогнутые или булавовидной формы; встречаются шаровидные клетки, неподвижны, опор не образуют, грамположительные и грамотрицательные, Размером 0,5 - 0,8(1 - 3 лк (шаровидные клетки 0,6 - 0,8 лк). В кислотах не окрашиваются,Культуральные свойства.Минеральная среда. Агар: рост значительный; колонии круглые гладкие, сплошные, бледного желтовато-коричневого цвета, непрозрачные, блестящие. На косом агаре: рост значительный; колошении нитевидные, бугристые или плоские, блестящие, бледного желтовато- серовато-коричневого цвета, маслянистые. Бульон слегка мутный, с небольшим хлопьевидным осадком, Оптимальная температура развития - 20 - 30 С, рН среды 6,0 - 8,0, аэробные, факультативно анаэробные. Лакмусовое молоко остается без изменения или щелочная реакция; желатину не разжижает,10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 индол не выделяет, крахмал не гидролизует, нитратов не образует. Хорошо растет на средах, содержащих в качестве углерода и-парафины и вырабатывает большое количество Е-глютаминовой кислоты из и-парафинов или уксусной кислоты. В ыр а ба ты в ает кислоту из фруктозы и маннита; 2. Мсгососсцз рагаШпоу 11 сцз.Морфология. Шаровидной формы или в виде палочек. Размером 0,8 - 1,2 К 0,8 - 1,4 мк. Неподвижны, однако среди микроорганизмов, принадлежащих к этому виду, имеются некоторые культуры, обладающие небольшой способностью передвигаться. Грамположительные,Минеральная среда. Рост ограничен плоскими культурами на агаровом бульоне. На косом агаре рост незначителен. Культуры нитевидной формы блестящие, ярко-красного или красновато-оранжевого цвета, маслянистые, На бульоне образуется небольшая мутность и осадок. На поверхности роста нет. Оптимальная температура развития 25 - 37 С. рН среды 6,0 в8,0. Аэробные, возможно анаэробные. Лакмусовое молоко не изменяет, желатину не разжижает, сероводород не выделяет, индол :не выделяет, крахмал не разлагает. Соль азотной кислоты восстанавливает (существуют некоторые виды, которые не вызывают восстановления соли азотной кислоты). При применении и-парафинов в качестве источника углерода рост отличный, при этом вырабатываются аминокислота и карбоновая кислота, в особенности 1.-глютаминовая кислота и альфа-кетоглутар овая кислота.Отношение к сахарам. Хорошо использует фруктозу, хуже глюкозу и манозу.3. Вгечйас 1 ег 1 шп Ее 1 одц 1 аппсшп.Морфология. Короткие палочки, но иногда встречаются относительно длинные клетки. Размеры их 0,7 - 0,9 х,0,8 - 3,0 мк, неподвижны грамположительные,Минеральная среда. На агаре в чашках Петри рост умеренный. Культуры в виде зерен, плоские и гладкие, плотные, непрозрачные, блестящие. На косом агаре рост умеренный, Культуры нитевидные, блестящие, бледно-красновато-оранжевого цвета; маслянистые. На бульоне образуется небольшая мутность и осадок, на поверхности образует пленку. Оптимальная температура развития 25 - 37 С, при температуре 37 С рост значителен. Оптимальная величина рН среды 6,0 - 8,0. Аэробные, могут быть анаэробные. Лакмусовое молоко не изменяет или изменяет в щелочное, желатину не разжижает, сероводород не выделяет, индол не образует, крахмал не разлагает, соль азотной кислоты восстанавливает. При использовании ичпарафинов в качестве источника углерода рост отличный с вы. делением альфа-кетоглутаровой и 1.-глютаминовой кислот и аланина. Отношение к сахарам. Использует глюкозу, фруктозу и сахарозу незначительно, мальтозу не использует.266649 Предмет изобретения Сост а в п тель Т. Поля иская Редактор Н. Д, Воликова Тсхред Л. Я, ЛевикаКорректор Л. С. Ве:енееза Заказ 21277 Тираж 480 ПодписноеЦП 1 ЛИПИ Комитета по дедам изобретений и открытий прп Совете Мпппстров СССРМосква, Ж, Раушская паб., д. 4,5 Типография, пр. Сапупова, 2 4. СогупеЬас 1 ег 1 шп ЬудгосагЬос 1 аз 1 цз.Мор фология. Палочки р аз мер ом 0,83,0 мк, Шаровидная форма и разветвления встречаются редко. Споры не образует. Неподвижны, Некислотоустойчивы. Грамположительны.Минеральная среда. Колонии на агаре круглые, гладкие или с мелкими морщинами, выпуклые, сплошные, бледно-,розового цвета, непрозрачные, маслянистые. На косом агаре: рост умеренный, нитевидной формы, блестящие или тусклые, гладкие или морщинистые, бледно-розового цвета, На бульоне хрупкая пленка, желатину не разжижает, молоко не изменяется, молоко В. С. Р. щелочное, не пентонизирует. Картофель: умеренный рост. Нитраты не восстанавливает в нитриты, индол не выделяется, ацетилметилкарбонол не выделяет, сероводород выделяет (некоторые культуры не выделяют Н,5). Крахмал не гидролизует, некоторые культуры крахмал гидролизуют. Из глюкозы образует кислоту, но газа не образует. Аэробная кислота получается из глюкозы спс:обом Хюга и Лейфсона (Нцдй апд 1.е 11 зоп). Из ксилозы, сахарозы, лактозы и крахмала не образуется ни кислот, ни газа. Глюкоза, глюконат, цитрат, соль янтарной кислоты, роксибензоат и протокатехоат используются как единственный источник углерода. Использование бензоата зависит от вида культуры. Соль салициловой кислоты, я-оксибензоат, гентисат и антралинат не используются в качестве единственного источника углерода. Керосин, н-декан, н-ундекап, н-додекан, и-тетрадекан и н-цетан используются в качестве единственного источника углерода. Оптимальная температура развития 25 - 30 С. Спосоо получения 1-лизина путем выращивания продуцирующих его микроорганизмов на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода углеводородные фракции нефти в присутствии необходимых для роста минеральных солей и стимуляторов роста с последующим выделением 1-лизина из культу- ральной жидкости одним из известных спосо бов, например при помощи понообменныхсмол, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода 1-лизина, в качестве продуцентов используют штамм АгйгоЬас 1 ег рага 1 йпецз (ЛТСС 21003), требующий для своего разви тия гомосерин, а также штаммы ВгеиЬас 1 ег 1 цгп 1 се 1 од 1 ц 1 апцсцгп (ЛТСС 21004) и СогупеЬас 1 ег 1 цгп Ь с 1 госагЬос 1 аз 1 цз (АТСС 2/131), требующие для своего развития метионпн и треонин.