Способ определения устойчивости зерна кукурузы к фузариозу

СОЮЗ СОВЕТСКИХ СОЦИА 1 ИСТИЧЕСКИ 8414 РЕСПУБЛИ)5 А 01 Н 1/О ИЕ ИЗОБ ВИДЕТЕЛ ЬСТВУ ПИСА 1 ъеЩююаеи гюСгщ,.льр ОРСКО государственныйия воссоединениянниченко, Л.Ф.За.Маршацк ийриимчифузари ть нева укурузы 1983, М ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕВЕДОМСТВО СССР(56) Флоря М.В. Повысивость высоколизиновой козу.// Защита растений,Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к определению потенциальной устойчивости к неблагоприятным факторам растений кукурузы в селекционном процессе.Известны способы определения устойчивости зерна к инфекционным заболеваниям, заключающиеся в заражении растений возбудителями болезней, выдерживании их в оптимальном для развития патогенов режиме и дальнейшем определении повреждаемости растений, на основании чего судят об устойчивости сорта к данному патогену, Выполнение этих способов требует проведения полевого эксперимента или работ с культурой ткани растения.Известны биохимические способы определения устойчивости семян к вредным организмам, основанные, например, на измерении содержаня хлорофила "а" и суммы каротиноидов в 9-дневных проростках семян сахарной свеклы; на оценке электрофоретического спектра компонента пероксидаз в семенах вики, на исследовании аминокислотного состава семян, К недо(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ ЗЕРНА КУКУРУЗЫ К ФУЗАРИОЗУ (57) Использование; биотехнология, сельское хозяйство, фитопатология. Сущность изобретения: устойчивость зерна кукурузы к фузариозу определяют по величине поглощения свободных аминокислот, окрашенных нингидриновым красителем, при этом данный показатель устойчивых форм ниже такового у неустойчивых в 1,7-7,7 раза. 2 табл,статкам вышеупомянутых способов следует отнести их длительность и трудоемкость.Наиболее близким по сущности и достигаемому эффекту является способ отбора устойчивых форм кукурузы в условиях искусственного заражения. Способ заключается в инъекции початков в период их массового цветения суспензией конидий патогенов, Через 20 дней проводится учет пораженных початков по степени развития заболевания, затем по разработанной шкале и по общепринятым в фитопатологии формулам определяют устойчивые и неустойчивые к заболеваниям формы кукурузы.Длительная и трудоемкая методика позволяет провести анализ в течение 20 сут, требует проведения полевого эксперимента, работы с токсичными средами, что затрудняет йс пользование способа в селекционной практике.Целью изобретения является упрощение и ускорение способа,Поставленная цель достигается способом, который осуществляется следующим образом:Проводят экстракцию свободных аминокислот 70 о -ным водным спиртом из не- размолотого зерна, к экстракту добавляют нингидриновый раствор, нагревают, охлаждают, измеряют поглощение раствора в областях 400, 570 нм, Расчитывают оптическую плотность на 1 мл раствора на 1 г навески зерен. Полученные величины сравнивают с таковыми для форм кукурузы, контрастных по устойчивости, обычно различающихся в 2 - 10 раз. Устойчивые формы имеют значения более низкие, чем неустойчивые.В качестве иллюстрации способа приведены Данные по поглощению форм кукурузы устойчивых и неустойчивых к фузариозу (табл,1), 70 оводный спирт используется для экстракции свободных аминокислот из растительных объектов. Нингидриновый раствор готовили по известной процедуре, при этом добавляется избыток этого реактива, Время экстракции и количество добавляемого экстрагента обосновано экспериментально (табл,2). Величина поглощения, рассчитанная для определенного образца вданных.областях уф-спектра, является маркерным признаком для определенной формы кукурузы и обратно коррелирует с устойчивостью к фузариозу.Неустойчивые к фузариозу формы имеют измененный жирнокислотный состав оболочки, что, как показано в этом способе, обуславливает большую проницаемость свободных аминокислот из эндосперма.Группа образцов кукурузы 1 - б и 15 - 20 относятся соответственно к обычным и переведенным на основу опейкформам кукурузы, которые описаны как устойчивые и неустойчивые формы к фузариозу початков. Образцы 7-14, 21 - 28 получены в процессе селекционной работы во ВНИИ Кукурузы г,Днепропетровска. 7 - 14 характеризуются повышенной устойчивостью к данному патогену (заболеваемость 0-250 ), а для образцов 21 - 28 характерна заболеваемость более 800 , что установлено экспериментальными данными трехгодичного полевого эксперимента,Полученные результаты свидетельствуют о том, что способ позволяет выявить формы кукурузы обладающие повышенной (пониженной) устойчивостью к фузариозу початков.П р и м е р 1. В стеклянные пробирки помещаем по 5 зерен, предварительно взвешенных, (одновременно тестировать можно 19 образцов+ контроль) заливает 2 мл 700 этанола. Контрольный опыт проводим без зерна. Помещаем пробирки в сосуд с кипящей водой на 10 мин, охлаждаем. Сливаем экстракт в заранее приготовленные пробирки, смывает небольшим количеством 70 этанола зерна еще раз и доводимобъем экстракта до 1 мл. Добавляем по 1 мл5 нингидринового раствора и нагреваем накипящей водяной бане в течение 6 мин (время проведения полной реакции нингидринас аминокислотами в капиллярном реактореаминокислотного анализатора. Измеряют10 поглощение окрашенного раствора в 0,1 смкювете при 400 и 570 нм на спектрофотометре Спекорд М(возможно применение фотометров). Рассчитывают величинуоптической плотности на 1 г навески зерна,15 1 см кюветы, 1 мл экстракта, Результатыпредставлены в табл.1. Данные статистически достоверны. Ошибка измерения не более 5 о .Данные, приведенные в табл.2, свиде 20 тельствуют о том, что уменьшение времениэкстракции приводит к слабой различаемости данных по устойчивой и неустойчивойформе;вследствие недостаточной Экстракциисвободных аминокислот опыт 1), Уве 25 личение времени нецелесообразно, т.к,соотношение величин сохраняется (опыты 2и 3) по сравниваемым формам. Уменьшениеколичества растворителя (опыт 4) приводитк тому, что часть семян оказывается непок 30 рытыми растворителем и не обеспечиваетполной экстракции. Увеличение количестварастворителя не приводит к значительнымизменениям, поэтому не является целесообразным. Таким образом, время экстракции35 10 мин, и количество растворителя - 2 млявляются оптимальными для достиженияожидаемого эффекта,Отличительными особенностями способа являются анализ величин оптических40 плотностей экстракта свободных аминокислот из целого зерна кукурузы и выявлениеустойчивых и неустойчивых форм кукурузыпо этим величинам в областях поглощенияокрашенных производных аминокислот,45 По указанным отличительным признакам был проведен патентный поиск. Аналогичных решений не обнаружено, поэтомууказанные признаки являются существенными.50 Использование предлагаемого способав сравнении с прототипом позволит упростить и ускорить проведение отбора путемисключвния длительных и трудоемких операций, уменьшить количество анализируе 55 мого селекционного материала.Способ прост в техническом исполнении и позволит существенно повысить интенсивность селекционной диагностики длявыявления устойчивых и неустойчивых образцов кукурузы к фузариозу початков.1784140 исследуемого показателя измеряют величину поглощения окрашенных нингидриновых растворов свободных аминокислот, извлеченных из целого зерна, и к устойчивым относят формы, величина поглощения кото рых в 1,7 - 7,7 раз ниже, чем значение данного показателя у контрольных неустойчивых форм. Формула изобретения Способ определения устойчивости зерна кукурузы к фузариозу, включаюгдий исследование показателя влияния патогена на оцениваемые растения и сравнение его с показателем контрольных растений, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения и ускорения определения, в качестве 10 Таблица 1 Величины оптических плотностей экстрактов иэ зерна различных форм кукурузы ОбразецНеустойчивые формы Отношение неуст. о маУстойчивые формы устойч. форма 0400 НМ 0570 нм 0400нм 0570нм 0400 нм 0570 нм Таблица 2 Величины оптических плотностей водно - спиртовых экстрактов из 5 зерен устойчивой и неустойчивой формы кукурузы при различных условиях экстракции