Способ подготовки биологической ткани к растровой электронной микроскопии

. СОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 1772749 ИЕ ИЗОБРЕТЕН ОПИС ктетеют и мин ст ство- воде одгои пол- ение раз ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТ И ГКНТ СССР АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(56) Авторское свидетельство СССР(54) СПОСОБ ПОДГОТОВКИ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ТКАНИ К РАСТРОВОЙ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ(57) Использование: в области биологии имедицины и предназначено для созданияравномерной электропроводности ткани Изобретение относится к области био. логии и. медицины и предназначено для создания равномерной электропроводности ткани перед ее исследованием в растровом электронном микроскопе.В настоящее время существует несколько способов придания свойств электропроводности биологическим тканям: покрывают их тонким слоем металлов (золотом, платиной, палладием, осмием), напыляют углеродом с последующим нанесением слоя блугородного металла. Обрабатывают в растворе четырехокиси осмия с последующей пропиткой иодидами металлов и ацетатом свинца, выдерживают в тиокарбогидразиде или таниновой кислоте, а затем обрабатывают четырехокисью осмия.Наиболее близким по технической сущности и принятым за прототип является способ придания злектропроводности тканям в растворах солей благородных металлов.(Я)5 6 01 й 33(48 О 01 й 1(288 перед ее исследованием в растровом э ронном микроскопе. Сущность изоб ния; биологическую ткань фиксиру затем обрабатывают в течение 10-15 смесью, содержащей следующие комп ты, мас,: Сц 5045 Н 20 5 - 6; Еп 5 7 Н 20 7 - 8; 25 аммиака 12 - 15; вода - остальное; а затем в 2-2,5 ра ре Иа 23 9 Н 20 на дистиллированной в течение 0,5-1 мин, При этом время и товки образцов сокращается в 2 раза ностью исключается примен драгоценных металлов. Основным недостатком этого способа является длительное время подготовки тканей к исследованию, а также использование драгоценных металлов.Целью изобретения является сокращение времени подготовки материала и повышение экономичности способа.Указанная цель достигается тем, что в способе подготовки биологической ткани к растровой электронной микроскопии, включающем фиксацию препарата и обработку солями металлов, согласно изобретения, после фиксации проводят обработку солями металлов в растворе, содержащем;Со 504 5 Н 20 - 5-6 мас.Еп 304 Н 20 - 7-8 мас.25 аммиака - 12 - 15 мас.вода дист. - остальноес последующей обработкой в 2-2,50 ь растворе Ма 23 9 Н 20.Способ осуществляется следующим обОбразецткани фиксируют 2-2,5-ным раствором глутарового альдегида в 0,1 М фосфатном буФере в течение 2-2,5 ч, отмывают от фиксатора в дист, воде и на 10-15 мин при комнатной температуре погружают в раствор, состоящий из;Со 304 5 НгО - 5 - 6 мас.Еп 507 НгО - 7 - 8 мас.25 О аммиака - 12 - 15 мас,дист. вода - остальное.Далее объект переносят на 0,5 - 1 мин в горячую проточную воду (55 - 60 С). Затем выполняют сульфидирование ткани в 2- 2,5;ъ раствора йагЗ 9 НгО при комнатной температуре. Промывку производят в проточной воде в течение 0,2 - 0,5 мин, Далее объект обезвоживают одним иэ способов, применяемых в электронной микроскопии и изучают в раствором электронном микроскопе,При этом смесь препаратов готовят следующим образом,В дистиллированной воде (60 мл) растворяют сернокислую медь до полного растворения, затем сернокислый цинк, добавляют 25; аммиак, доводят объем до 100 мл дист, водой.П р и м е р 1, Биопсийный материал в виде кусочка ткани печени был зафиксирован в 2,5-ном растворе глутарового альдегида на 0,1 М фосфатном буфере в течение 2 ч, тщательно промыт в дистиллированной воде. Затем на 15 мин при комнатной температуре был погружен в раствор, состоящий из, мас.ф.Со 3045 НгО - 5ЕпЯ 047 НгО - 7257, аммиак - 12дист. вода - остальное.Далее препарат был перенесен на 1 мин в горячую (60 С) проточную воду, Затем выполняли сульфидирование ткани в 2,5;6- ном растворе йагЯ 9 НгО при комнатной температуре в течение 1 мин. Промывают 0,5 мин в проточной воде, После этого подготовленный таким образом материал обеэвоживали в спиртах восходящей концентрации от 30 до 100 О, наклеивали обьект на подложку и изучали в.растровом электронном микроскопе,5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Было отмечено, что данная обработка не повлияла на качество изображения исследуемого материала и на получаемую при этом информацию. Качество иллюстраций, полученных предлагаемым способом, не уступает результатам при использовании способа прототипа,П р и м е р 2, Участок подколенной вены фиксировали в течение 2 ч в 2,5-ном растворе глутарового альдегида, промывали в дист. воде, Погружали на 10 мин при комнатной температуре в раствор, состоящий из, мас.;:Со 504 5 НгО - 6Еп 504 7 НгО - 8257 ь аммиак - 15дист. вода - остальное.Затем препарат перенесли на 1 мин в горячую воду. Сульфидирование выполняли в 2-ном растворе йагЯ 9 Нг 0 в течение 1 мин при комнатной температуре, Промыли 0,5 мин в проточной воде. Далее подготовленный материал обезвоживали в спиртах восходящей концентрации от 30 до 100, наклеивали на подложку и изучали в растровом микроскопе.Поверхность эндотелия, участка подколенной вени, обработанной данным способом, имеет оптимальный контраст, внутрисосудистые образования, нити фибрина. Для сравнения с прототипом была исследована поверхность биопсийного материала органов пищеварения, сосудов и камней желчного пузыря у 72 больных по предлагаемому способу и способу прототипу.Исследования проводили при различных увеличениях микроскопа ЕМ - 100 Я с растровой приставкой АЗИД - 5(Япония) (см. таблицу).При этом отмечено, что качество иллюстраций, полученных предлагаемым способом, не уступает результатам при использовании способа-прототипа. Кроме того, кристаллические образования выглядят более контрастнее и отчетливее, а время подготовки образцов к исследованию сокращается в 2 раза (беэ учета времени фиксации),Формула и зоб рете ни я Способ подготовки биологической ткани к растровой электронной микроскопии путем ее фиксации с последующей обработкой солями металлов, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью сокращения времени подготовки и повышения экономичности способа, обработку ткани проводят в течение 10 - 15 мин смесью, содержащей следующие компоненты, мас, СеЮ 4 5 НгО - 5-6; Еп 5047 НгО - 7 - 8; 25 о,-ный аммиак - 12-15 и дистиллированная вода - остальное, а затем в течение 0,5 - 1 мин 2 - 2,5- ным раствором МагЯ 9 НгО.1772749 Зависимость качества иэображения в растровом электронном микроскопе от концентрации используемых растворовКон ент а ия аство в Реэультаты иэображения Сернокислвя ме ь Сернокислый инк Суяьфид нат ияАммиак 25Низкий контраст, наличие бликов Умеренный контраст, наличие слабых бликов Оптимальный контраст, блики отсутствуют Оптимальный контраст, бликов нет Повышенный контраст, резкость иэображения снижена Высокий контраст, резкость изоб ажения снижена1,5 12 2,5 13-15 10 Составитель Е,ТумасоваТехред М.Моргентал Корректор Л,Ливринц Редактор А.бер Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 Заказ 3844 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5