Способ определения цитотоксичности бактерий

(19) (11) 51)5 С 1 Й 5/00 РЕТЕНИЯ АВТОРСКОМ СВИДЕТЕЛЬСТВУ при цент- нных на о стекла; ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТГ 1 РИ ГКНТСССР ОПИСАНИЕ ИЗ 11) 4767514/13 Ф 2) 08,12.89; 46) 15.07.92. Бюл, йт 26 71) Киевский научно-исследовательский инетитут эпидемиологии и инфекционных болезней им.Л,В.Громашевского:72) А.Ф.Фролов, Л;В.Пархоменко, В,П.Жалко-Титаренко, Л,В,Тимохина и Ю.П,Галагуза (53) 576,8.097.29 (088,8) (56) МауаИ В,С. ет а 11, Мес 3. МсгоЫо 3 ч. 24; и. 3, р. 197. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ БАКТЕРИЙ 57) Изобретение относится к области мик. робиологии и может использоваться для опИзобретение относится к биологии и медицине, а именно к медицинской микробиологии, и может использоваться для выявления патогенных свойств микроорганизмов и изучения их биологического действия.Цель изобретения - упрощение и повышение точности способа.Указанная цель достигается тем; что органнуюкультуру кишечника или другого , эпителиального органа культивируют в жидкой пйтательной среде в присутствии цито- токсической суспензии бактерий в контейнере над покровным стеклом, затем цейтрифугируют и по количеству отслоив-;шихся клеток определяют цитотоксичностьС по формулеС= - (1 -- )й 919 о 1где й - количество отслоившихсярифугиовании клеток, подсчита1.96 мм по диагоналям покровног ределения и изучейия биологических свойств бактерий, отбора вакцинных штаммов - продуцентов цитотоксинов, прогнозирования тяжести течения заболеваний и оценки эпидситуаций, Сущностью изобретения является упрощение, повышение точности и эффективности технологического процесса, Для этого органную культуру эпителиальной ткани инкубируют со взвесью бактерий и центрифугируют при определенной ориентировке - горизонтально над предметным стеклом, что обеспечивается размещением органной культуры в специальном проволочном контейнере, а учет цитотоксичности проводят после подсчета слущенных на покровное стекло эпителиальных клеток по формуле. ФМф9 о - ускорение центробежной силы отслоения клеток, не обработанных цитотоксической суспензией бактерий;91 - ускорение центробежной силы отслоения клеток, обработанных цитотоксической суспензией бактерий;т - время воздействия цитотоксической суспензии бактерий, ч.Способ осуществляют следующим образом. р 1. В центрифужную пробир мл помещают 20 мл жидкой среды(ч. 199, Игла), в которую проволочный контейнер с заи в нем горизонтально на рассм двумя параллельными и стеклами, К нижней поверхго стекла биоклеем приклеиваую культуру - отмытый ским раствором фрагмент киша мыши 1,0 Х 1,0 см, Можно исП римеку емкостьюпитательнойпомещаюткрепленнымстоянии 1предметнымности верхнеют органнфизиологичеки кишечникпользовать органную культуру человека или Результаты исследований приведены в животных, Размещенную таким образом си- таблице, -стему инкубируют 15 мин в термостате,Из полученных данных видно, что предЗатем пробирку с органной культурой лагаемый способ более чувствителен чем изцентрифугируютвдискретном режиме воз вестный, так как позволяет определить растающих ускорений центробежной силы цитотоксичность, когда известным способом и определяют д - "ускорение, при котором она не определяется, Способ дает возмождостигается полное отслоение эпителиаль- ность проводить определение в количественных клеток интактной органной культуры ном выражении, что значительно точнее (контроль). Для использованной органной 10 известного. Точность предлагаемого способа культуры кишечника мыши д составляет составляет 100%, известного 40%, Кроме то 270 д: . го, для осуществления способа не требуетсяЗатем в четыре опытные пробирки с дорогостоящихреактивовиоборудования,онидентичной культурой вносят суспензию отличается простотой, так как включает семь штамма Я.бузептегае720/69(Институт Па несложных технических приемов и занимает стера) в концентрации 5 10 КОЕ/мл, инку,75+ 0,51 на 1 определение (известный спобируютв термостате при 37 С в течение 30 соб - 32 технически сложных приема и мин, центрифугируют и находят минималь,52 0,57 сут соответственно).ное ускорение, йри котором происходит от- Таким образом, предлагаемый способ . слоение клеток эпителия, После .20 более доступен для широкого исследовацентрифугирования покровные стекла с от- ния, по сравнению с электронной, особеннослои вшимися клетками осторожно извлека- сканирующей микроскопией,ют, подсушивают, фиксируют., красят поРомановскому-Гимза и подсчитывают коли- Предлагаемое определение цитоток чество клеток по диагоналям покровного 25 сичности в количественных показателях дастекла на площади 1,96 мм . На четырех ет возможность проводить объективную . опытных стеклахподсчитано соответствен- оценку свойств штаммов микроорганизмов,но 200, 184, 202; 182 клетки. Полученные особенно энтеробактерий, отбор отдельных данные подставляют в формулу и определя- штаммов, продуцентов цитотоксинов для ют цитотоксичность. В опытных пробирках 30 эпителиальной ткани, вакцинных штамцитотоксичность-составляла 135, 133, 123, мов, штаммов для моделирования инфекци. Таким образом средняя и ошибка сред- он н ы х процессов, а также проводить нейс вероятностью 95% для четырех опре- типирование штаммов и прогнозирование делений составляет 128%4 тяжести течения заболеваний,П р и м е р 2. Согласно предлагаемому 35 Ф о р м у л а и з о б р е т е н и яспособу определяют цитотоксичностьСпособ определения цитотоксичности штамма Я,Иехпег М 516, Отслоение эпите- бактерий, включающий исследование клелиальных клетоК после цитотоксического ток тканей, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с - влиянияштаммавчетырехопйтахотмечено целью упрощения и повышения точностипри 150 д в количествах 121, 147, 145, 123 40 способа, органную культуру эпителиальной ,клетки на 1,96 мм, что соответствует при ткани инкубируют 5-60 мин в присутствии подсчете по формуле показателю цитоток- цитотоксической суспензии бактерий в консичности 119,4+ 12,45 (средняя и ошибка центрации (5-8)10 КОЕ/мл в контейнере средней с вероятностью 95% для четырех над покровным стеклом, затем центрифуги- определений). 45 руют и по количеству отслоившихся клетокП р и м е р 3. СоглаСно предлагаемому определяют цитотоксичность С по формулеспособу определяют цитотоксичность, Ь 3 р)штамма Е.со М 17, по данным ряда иссле цодователей не обладающего цитотоксично- где К - количество отслоившихся при цент- стью. Концентрацию бактериальной 50 рифугиовании клеток, подсчитанных на суспензии увеличивают до 8 10 КОЕ/мл, Б 1,96 мм по диагоналям покровного стекла;8остальном определение проводят аналогич- до - ускорение центробежной силы отно примеру 1, Показатель цитотоксичности слоения клеток, не обработанных цитотокпо четырем определениям соответствовал сической суспензии бактерий;12 ф 5,2, подтверждая отсутствие цитотоксич р - ускорение центробежной силы отностй данного штамма. слоения клеток, обработанных цитотоксичеП р и м е р 4, Проводят определение ской суспензией бактерий;цитотоксичности 12 различных штаммов т - время воздействия цитотоксической бактерий по предлагаемому и известному: суспензии бактерий, ч.способам.1747483 ны средние и ошибка средней для четырех измерений Составитель С,ПыловаРедактор С.Лисина Техред М.Моргентал . Корректор М.Демчик 101 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гага Заказ 2473 Тираж ВНИИПИ Государственного к 113035, МПодписноеитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССРква, Ж, Раушская наб., 4/5