Способ определения гепарина в плазме крови

(5)5 6 01 И 33/52 ЕТЕНИЯ ИЗ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ОБРК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(56) Авторское свидетельство СССР М 1075164, кл. 6 01 й 33/48, 1983,(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕПАРИНА ВПЛАЗМЕ КРОВИ(57) Изобретение относится к медицине, вчастности к лабораторным методам определения концентрации гепарина в плазме крови. Цель изобретения - повышениеточности способа и его ускорение. Способ Изобретение относится к медицине, ачастности к лабораторным методам определения концентрации гепарина в плазме крови.Цель изобретения - повышение точности способа и его ускорение.Способ осуществляют следующим образом,Плазму крови разводят, добавляют водный раствор нестехиометрического интерполиэлектролитного комплекса,содержащего полиметакрилат натрия, ме-.ченный флуоресцентной меткой , и полий-атил-винилпиридиний .брамид приосномольном соотношении компонентов10:1 - 2:1 и концентрации комплекса 10 . -10 основомолей по метакрилату состоит в титровании плазмы крови водным раствором интерполиэлектролитного комплекса. состоящего из полиметилакрилата. натрия, меченного флуоресцентной меткой, и поли-й-.этил-, винилпиридиния бромида при основа-малярном соотношении компо- . нентов 10:(1 - 2):1 и концентрации комплекса 10 -10 осново-молей/л по метакрилату. Раствор комплекса добавляют в плазму до достижения точки излома кривой зависимости интенсивности флуоресценции от количества добавленного комплекса с последующим расчетом количества гепарина по калибровочной кривой. Изобретение позволяет повысить чувствительность способа в 20 раз и ускорить его не менее, чем в 4,5 раза, 1 табл. 4Добавление раствора производят аликвотами до появления резкого изменения интенсивности флуоресценции, т,е. додостижения точки излома (точки эквивалентности) на кривой зависимости интенсивности флуоресценции от количества Одобавленного полиэлектролитного комплекса,Расчет концентрации гепарина прово- ддят с использованием предварительно построенной калибровочной кривойзависимости интенсивности флуоресценции от концентрации гепарина,П р и м е р 1. Плазму получают центрифугированием цельной крови, взятой в силиконированные пробирки, содержащие3,8,-ный раствор цитрата натрия в объемном соотношении 9;1 (15 мин со скоростью3000 об/мин). Полученную таким образомплазму разводят раствором трис-буфера всоотношении 1;4.Подготовительным этапом является построение калибровочного графика, пригодного для работы весь период использованияприготовленного раствора интерполиэлектролитного комплекса, который может храниться в течение длительного времени (неменее месяца) в условиях бытового холодильника (+4 С). Для работы использовалсяраствор 0,04 основомоль/л полиметакрилата натрия (мол,масса 3500, одна пиреноваяметка на 260 мономерных звеньев), раствор0,01 основомоль/л поли-М-атил-винилпиридиний бромида (мол.масса 290000 (соотношением компонентов комплекса 1;3) и0,05 М трис-буфер с 0,05 М ИаС, Растворнестехиометрического интерполиэлектролитного комплекса готовят путем добавления к 0,5 мл раствора полиметакрилатанатрия 0,67 мл раствора поливинилпиридиний бромида, затем добавляют 0,2 мл0,1 М раствора гидроокиси натрия и 3,63мл трис-буфера, Рабочий раствор готовятразведением исходного раствора интерполиэлектролитного комплекса до концентрации от 10 до 10 раствором 0,05 МИаО в трис-буфере,Измерение проводят на флуориметре1 УЗ СЯ, длина волны возбужденйя 343 нм,длина волны регистрации 395 нм.Для построения калибровочного графика в кювету, помещенную в флуориметр,вносят 2,0 мл разведенной плазмы, добавляют 10 мкл раствора интерполиэлектролитного. комплекса и регистрируютзначение интенсивности флуоресценциикак.начальную точку калибровочной кривой,Затем новую порцию плазмы, содержащую0,005 ЕД гепарина, титровали рабочим раствором интерполиэлектролитного комплекса порциями по 10 мкл. Точка изломазависимости интенсивности флуоресценции от количества добавленного раствораполиэлектролитного. комплекса соответствует оттитрованному гепарину.Аналогичная процедура проводится собразцами плазмы, содержащими 0,01;0,015; 0,02; 0,025; 0,03 и т.д. до количества. 1,0 ЕД гепарина.Процедура исследования тестируемогообразца плазмы протекает в пределах одной минуты и заключается в последовательном добавлении аликвот (10 мкл)нестехиометрического полиэлектролитногокомплекса в рабочую кювету флуориметра,По точке излома кривой флуоресценции накалибровочной кривой определяется реальное значение количества гепарина в тестируемом образце плазмы.Чувствительность метода 0,005 ЕД/мл.К 1 мл образца плазмы кролика добав ляют 0,1 мл 0,00106-ного раствора гепаринафирмы "Рихтер" (Венгрия) с активностью 130 ЕД/мг. В процессе титрования раствором интерполиэлектролитного комплекса в концентрации 10 5 точка излома наступает10 после внесения шестой порции титрующегоагента (60 мкл), что составляет по калибровочному графику 0,0275 ЕД. Результат подтверждает, соответствие установленного количества гепарина внесенному в плазму 15 перед титрованием. Титрование продолжалось 20 с.П р и м е р 2. По методике, описаннойв примере 1, определяют концентрацию гепарина в плазме крови массой 4 кг, в кра евую вену уха которого введен гепарин вдозе 50 ЕД/кг, Кровь берут через 5 мин после введения антикоагулянта. Используют раствор интерполимерного комплекса в рабочей концентрации 10, В результате 25 титрования плазмы интерполиэлектролитным комплексом в указанной концентрации определена точка излома, которая соответствует 0,175 ЕД гепарина. Титрование продолжается 45 с.30 П р и м е р 3, В плазме крови кролика,полученной в условиях, описанных в примере 2 и по методике, описанной в примере 1, определяют концентрацию гепарина с использованием рабочей концентрации ин терполиэлектролитного комплекса, равной10, В результате титрования плазмы интерполиэлектролитным комплексом в указанной концентрации определена точка излома, которая соответствует 0,175 ЕД ге парина. Титрование продолжается 40 с,П р и м е р 4. Определение гепаринапроводят, как в примере 1 при разных соотношениях компонентов полиэлектролитного комплекса и его концентрации 10 45 основомоль/л, Данные представлены в таблице.Таким образом, преимуществами предложенного метода перед известным являются предел обнаружения гепарина в 50 плазме 0,005 ЕД (в 20 раз выше, чем поизвестному способу) и экспрессность метода-определение длится не более 60 с (по известному способу не более 4,5 мин) за счет определения концентрации гепарина 55 только в одном объеме плазмы крови примногократно повторяемой манипуляции последовательного добавления к ней постоянного объема водорастворимого нестехиометрического интерполиэлектролитного комплекса, содержащего флуореседактор И.Сегляник Т Корректор М,Кучерява каз 769 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СС113035. Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 оизводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород гарина,центную метку, В случае массовых обследований время трудозатрат снижается более,чем в 4 раза. Формула изобретения Способ определения гепарина в плазме крови, включающий титрование плазмы раствором нестехиометрического интерполиэлектролитного комплекса на основе соли . поликарбоновой 1кислоты и полимерного основания, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения точности способа и его ускорения в качестве, интерполиэлектролитного комплекса используют водный раствор полиметакрилата натрия, меченного флуоресцентной меткой, и полий-этил-винилпиридиния бромида при ос новомолярном соотношении компонентов10 - 2;1 и концентрации комплекса 10 10 з основомоль/л по метакрилату, раствор комплекса добавляют в плазму до достижения точкой излома кривой зависимости ин тенсивности флуоресценции от. количествадобавленного комплекса с последующим расчетом количества гепарина по калибровочной кривой,