Способ диагностики аллергии

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 9) 51)5 О 01 М ЗЗ/533 Ф1 ИЕ ИЗОБРЕТЕ Изобретение отнастности к аллергол Цель изобретенити и ускорения спос Способ осуществ сится к медицине- повышение точноба, ют следующим обра ГОСУДАР СТВ Е ННЫ Й КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Ленинградский педиатрический медицинский институт(56) Чучалин А.Г., Бражникова Н,АНовиковЮ.К., Трескунова В.В., Коркина Л,Г, Флуоресцентный зонд - в оценке функционального состояния лимфоцитов - Советскаямедицина, 1985, М 10, с.28 - 30.(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АЛЛЕРГИИ(57) Изобретение относится к медицине, аименно к аллергологии, и может быть использовано для выявления причинно-значимых аллергенов у больных саллергическими заболеваниями. Цель изоэом.У больного берут кровь из пальца или из вены в гепаринизированную пробирку(количество крови зависит от того, на какое количество аллергенов необходимо определить реакцию-для определения реакции нк 1 аллерген достаточно 0,5 мл крови). Пробирку с кровью оставляют при комнатной температуре на 45 мин под углом 45 и еще на 45 мин в вертикальном положении для расслоения крови на плазму с лейкоцитами и осадок эритроцитов, После отстаивания . плазму с лейкоцитами собирают в отдельную пробирку и наслаивают ее на градиент плотности фиколл-верографин 1,077, центбретения - повышение точности и ускарние способа. Дпя осуществления способа по 0,15 мл гранулоцитов периферической крови в концентрации 2 10 (мп вносят в опытную и контрольную пробирки. В опытную пробирку вносят аллерген, в контрольную - . раствор Хенкса. Через 30 с обе пробы окрашивают флуоресцентным кальциевым красителем каином, а затем измеряют интенсивность флуоресценции клеток в контрольной и опытной пробах с помощью проточного цитофлуотиметра. Сравнивают координаты средней точки гистограмм, полученных в контрольной и опытной пробах, и при смещении средней точки гистограммы опытной пробы вправо по оси абсцисс по сравнению с контрольной на 10, и более диагностируют аллергию к данному алпергену. рифугируют пробирку 30 мин при 3009 при комнатной температуре. После центрифугирования на градиенте плотности образуется кольцо лимфоцитов, его снимают и используют для других целей, а осадок, содержащий гранулоциты с небольшой примесью эритроцитов, трижды промывают раствором Хен кса (т,е. центрифугируют 15 мин при 300 9) и ресуспендируют гранулоциты в растворе Хенкса до концентрации 2 10/мл, Клетки разносят по 0,15 мл в 2 пробирки - контрольную и опытную. В контрольную пробирку добавляют 0,05 мл раствора Хенкса, а в опытную 0,05 мл аллергена, растворенного на растворе Хенкса до концентрации 2000 РИО(мл (конечная концентрация аллергена в суспенэии гранулоцитов таким образом составляет 500 РМО/мл. Через 30 с после внесения раствора Хенкса и аллергена в опытную и конт 1 б 9175115 20 25 30 35 40 рольную группу пробиркидобавляют по 2 мкл раствора квинав концентрации 500 мМ, а конечная концентрация краски в растворе составляет 5 мМ. Контрольную и опытную пробирки инкубируют в термостате при 37 С в течение 30 мин, По окончании срока инкубации измеряют интенсивность флуоресценции не менее 10000 клеток в контрольной и опытной пробирках с помощью проточного цитофлуориметра и возбуждение люминесценции проводят лучами с л, = 340 нм, регистрируя люминесценцию в области спектра 490 нм, Получа 1 от гистограммы, где по оси ординат обозначено количество клеток, а по оси абсцисс - интенсивность свечения, Полученные гистограммы обрабатывают с помощью стандартной измерительной программы В/У 2 фирмы Коп 1 оп 8 бараузе или любой аналогичной программе, С помощью этой программы на каждой гистограмме определяют координаты средней точки. Сравнивают координаты средней точки контрольной и опытной гистограмм и при смещении средней точки гистограммы опытной пробы вправо по оси абсцисс по сравнению с контрольной на 1 ОЯ и более диагностируют аллергию к данному аллергену.П р и м е р 1. Миша А., 8 мес., поступил в больницу сдиагноэом "Распространенная экзема", Болен с 4 мес., когда после введения прикормов (каши на коровьем молоке и овощные пюре) появились экзематозные проявления на щеках и на лбу, распространившиеся впоследствии по всему телу. Кожные и провокационные пробы с пищевыми аллергенами не проводились из-за тяжелого состояния ребенка и обширности кожных поражений.С помощью предлагаемого способа исследованы реакции гранулоцитов больного на аллерганы коровьего молока, пшеницы, картофеля, капусты, моркови, белка куриного яйца, трески, хека, Получено смещение средних точек гистограмм впоаво по оси абсцисс с аллергеном коровьего молока на 10аллергена пшеницы на 16, аллергена моркови на 19 ,. С остальными аллергенами пробы были отрицательными (смещение средней точки гистограммы на 0 - 9 Д); По результатам лабораторных проб с помощь.о предлагаемого способа диагностирована аллергия к коровьему молоку, манной каше (пшеница), моркови. Исключение этих продуктов из диеты ребенка уже через 3 недели привело к очищению кожных покровов и улучшению общего состояния ребенка, Провокационные пробы с коровьим олово, аой кашей и морковным соком были реэкоположительными, что проявлялось в обострении экземы и ухудшении общего состояния ребенка, Это подтвердило правильность диагностики с помощью предлагаемого способа.П р и м е р 2, Таня О., 12 лет, поступила в больницу с жалобами на зуд век, слезотечение, светобоязнь, насморк, проявляющиеся в весеннее время года, Впервые эти симптомы отмечены в возрасте 9 лет весной во время прогулки в парке, Заподозрена пальцевая сенсибилиэация, но провести кожные и провокационные пробы не представлялось возможным, так как больная поступила в период обострения заболевания и в весеннее время года, когда пробы с пыльцевыми аллергенами не проводятся. С помощью метода, изложенного в известном способе, исследованы реакции лимфоцитов периферической крови с аллергенами березы, ольхи, лещины. Получена слабоположительная реакция с аллергеном ольхи, с остальными аллергенами пробы были отрицательными, С помощью предлагаемого способа изучены реакции гранулоцитов больной на аллергены березы, ольхи, лещины, тимофеевки, овсянницы, райграса, лисохвоста, полыни, лебеды, амброзии. Получено смещение средних точек гистограмм проб с аллергеном ольхи (на 34 оь), пыльцы березы (на 52 оь) и лещины (на 29%). Больная девочка повторно поступила в больницу зимой следующего года, были проведены кожные пробы с пыльцевыми аллергенами, которые были резкоположительными с аллергенами пыльцы березы, ольхи и лещины, что подтверждает правильность диагностики. Изобретение позволяет обеспечить высокую точность диагностики аллергии (на 50, выше по сравнению с прототипом), что в 15 раз уменьшает количество необходимой для реакции крови, в б раз количество аллергена, в 2 раза продолжительность реакции. Формула изобретения Способ диагностики аллергии путем инкубации лейкоцитов периферической крови с аллергеном и измерения содержания кальция в клетках по интенсивности свечения в них флуоресцентного кальциевого красителя, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности и ускорения способа, из крови выделяют гранулоциты, в качестве красителя используют квинв концентрации 500 мМ, а измерение интенсивности свечения ведут на проточном цитофлуориметре по гистограмме и при смещении сред1691751 Составитель Р.ГуменюкРедактор Н.Федорова Техред М.Моргентал Корректор И.Муска Заказ 3924 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 ней точки гистограммы опытной пробы в сторону увеличения на 10 и более по оси интенсивности флуоресценции по сравнению с контрольной, содержащей растворитель. диагностируют аллергию к данному аллергену.