Способ отбора сортов и линий гороха с высоким содержанием триптофана

союз советскисоциАлистичесниРЕСПУБЛИН 1); Ао С 4 ОБРЕТЕНИЯ ИСАН АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬС Г бъед кая,следо- рмакоИзобретение относится к лиотехнологии, в частности к селекции растений, и может быть использовано для создания сортов с высоким содержанием незаменимых аминокислот, в частности триптофана.Цель изобретения - ускорение анализа и снижение его трудоемкости.Способ состоит в том, что оценку растений гороха на повышенное содержание триптофана ведут по наличию пероксидаз с относительной электрофоретической подвижностью 0,09-0, 12 и/или эстераз с относительной элект- рофоретической подвижностью 0,67- 0,70. Способ иллюстрируется следующими мерами. ОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТо изовртениям и отнецтиям1 и Гкнт ссо(56) Методы биохимического ивания растений/Под ред. А.М.ва, Л.: Колос, 1972, с. 3 13. ЯО 1556598(54) СПОСОБ ОТБОРА СОРТОВ И ЛИНИЙ ГОРОХА С ВЫСОКИМ СОДЕРЖАНИЕМ ТРИПТОФАНА(57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к селекционногенетическим исследованиям растений, и может использоваться при создании новых сортов гороха. Целью изобретения является ускорение анализа и снижение его трудоемкости, Способ состоит в том, что проводят электрофорез изоферментов зерна гороха и затем выявляют высокатриптофановые генотипы по наличию пероксидаз с относительной электрофоретической подвижностью (ОЗП) 0,09-0, 12 и эстераз с ОЗП 0,67-0,70. 2 табл. Пример 1. Берут 2 г семян ф 3 гороха сорта ЕеТоп. Семена очищают ЯД от семенной оболочки и зародыша, раз. фф малывают на электрической лаборатор- Яд ной мельнице "Пируэт", обезжиривают. ц Навеску муки 200 мг экстрагируют три- р сцистеиновым буфером в течение 1,5 ч на холоде при постоянном помешивании, После этого центрифугируют при 8 тыс.об/мин в течение 15 мин, Полученный супернатант используют для электрофоретического исследования изоферментного спектра эстераз и пероксидаз фщ в ПААГе. Злектрофорез проводят на электрофоретическом аппарате фирмы "Реанал". Трубочки, заполненныеполиакриламидным (застывшим) гелем закрепляют в электродной камере, вно 1556598Через 10 мин в пробирки с гелеми указанной смесью добавляют по0,2 мл перекиси водорода (37) иоставляют стоять гели н этой смеси20 мин, после чего сливают, промывают дис.тиллированной водой и фиксируют 207-ным этиловым спиртом,После проводят подсчет спектрабелковых компонентов (изоформ) пероксидаз и эстераз, используя миллиметровую линейку. Затем вычисляютотносительную электрофоретическуюподнижность каждого компонента (ОЭПили ЕМ),55 сят н них по 1 капле (0,033 мл) супернатанта, 1 капле сахарозы и 1 капле краски (бромфеноловый синий). Буфером для нижней и верхней электрод 5 ных камер служит трисглициновый буфер (рН 8,3).Электрофорез идет н холодильнике в течение 60 мин. Первые 15 мин электрофорез ведут при сне тока 2 мА на трубку, что способствует более равномерному распространению белка по всей поверхности геля. Затем устанав.- ливают силу тока 4 мА на гель, По окончании разгонки (белок проходит по всей длине геля в трубочке) гели вынимают .из трубочек, помещают в пробирки и заливают Фосфатным буфером рН 6,2, который сливают через 30 мин. Затем гели заливают на 30 мин смесью 20 приготовленной следующим образом: 150 мл фосфатного буфера рН 6,2, 300 мг прочного синего, 3 мл Ф-наф" тила, разведенного в 96 этиловом спирте. Эту смесь перед употреблением 25 фильтруют. Слив эту смесь, гели про мывают дистиллированной водой, а затем Фиксируют следующей смесью: 234 мл воды дистиллированной, 60 мл спирта, б мл соляной кислоты. После этого проводят подсчет. белковых компонентов (изоформ) эстераз.Дпя разгонки пероксидаз вначале проводят те же операции, что и при разгонке эстераз. Отличие н том, что после того, как гель вынимают из трубочек, его (гель) заливают на 20 мин буФером рН 4,8, приготовленным из 4,6 мл уксусной кислоты и 16 г уксуснокислого натрия и доведенным до 1 л дистиллированной водой, Через 20 мин гели заливают смесью, состоящей из 171 мл буфера рН 4,8,9 мл бензидина и 2,4 мл пирокатехина. Исследование компонентного состава пероксидаз показывает, что в спектре присутствуют компоненты с относительной электрофоретической подвижностью (ОЭП или К 2) 0,09, а в спектре эстераз 0,70. Сорт обладает высоким содер жанием триптофана.П р и м е р 2. Берут семена гороха сорта Койхейо, Готовят семена и проводят электрофорез по методике примера 1.Исследование компонентного состава пероксидаз показывает, что в спектре присутствуют компоненты с ОЭП 0,10, а в спектре эстераз - компоненты с ОЗП 0,67 0,68 и 0,70. Сорт обладает высоким содержанием триптофана.П р и м е р 3. Берут семена гороха сорта Горизонт, Готовят семена и проводят электрофорез по методике примераИсследование компонентного состава показывает, что в спектре пероксидаз присуствуют компоненты с ОЭП 0,06, а в спектре эстераз - компоненты с ОЗП 0,08. Сорт обладает низким содержанием триптофана.П р и м е р 4. Берут семена гороха сорта Зерноградский многоплодный.Семена готовят и проводят электрофорез по методике примера 1. В спектре эстераз присутствуют компоненты с ОЭП 0,07 и О, 11. Сорт обладает низким содержанием триптофана.Характеристика сортов гороха с различным содержанием триптофана приведена в табл;1 и 2,К образцам с высоким содержанием триптофана относят те, у которых в электрофоретическом спектре пероксидаз имеются компоненты с ОЭП 0,090,12 и(или),эстераз с ОЭП 0,67-0,70,Присутствие всех компонентов необязательно, это может быть один илинесколько компонентов, имеющих ОЭП вуказанных пределах,Образцы с низким содержанием триптофана имеют в спектре пероксидазкомпоненты. с ОЭП 0,06-0,08 и(или)н спектре эстераз компоненты с ОЭП0,04-0,12.Исследование злектрофоретическогоспектра пероксидаз и эстераз изучаемых сортов показало, что для сортов,обладающих повышенным содержаниемтриптофана, характрно наличие в спектре пероксидаз компонента с относительной электрофоретической подвиж51556598 6 ностью (ОЗП) 0,09-0,12 .(табл,1) и(или) создание нового сорта, снижает трудо- компонента эстераз с ОЭП Оэ 67-0,70 емкость селекционного процесса, (табл .2). Однако, как видно из дан- Формула и з о б р е т е и и я ных табл 1 и 2, необязательно при- Способ отбора сортов и линий госутствие всех компонентов в указанных роха с высоким содержанием триптопределах, в том числе и их граничных фана, включающий анализ и оценку исзначений. следуемых сортов и линий с последующим отбором по интересующему признаНаличие белкового маркера на повыку, о т л и ч а ю щ и й с я тем, щенное,содержание триптофана дает воз 10что, с целью ускорения анализа и сниможность эффективно вести оценку вжения его трудоемкости, анализ ведут питомнике исходного материала (послепутем электрофореэа изоферментов и гибридизации, мутагенеза и т.д.), чтоотбор сортов и линий с высоким сопозволяет выделить ценные генотипы надержанием триптофана осуществляют по ранних этапах селекционного процесса. 15наличию - них пероксидаз с относиИспользование предлагаемого спосо- тельной электрофоретической подвиж- ба оценки растений гороха на повышен- ностью 0,09-0,12 и/или эстераэ с отное содержание триптофана по срав- носительной электрофоретической поднению с известным сокращает время на 20 вижностью 0,67-0,70. Таблица 1 1 Относительная электрофоретическая подвнвность Количествотриптофана мт на 100 г сухого вещества Сорт 05 .0,06 0,07 0,08 О, 13 О,200 200 210 210 213 222 235 307 315 316 337 348 355 375 Местный Львовен, обл.ГоризонтПеленка местнаяГрузияРгещ 1 егЗер 1 эоградск. многопл.уагевРгоаепКо 1 тгеРо011 таргеКцЬв ооп ПгапС 1 о 01 тоГв Йов 1Регоп11 ап. н. г(сап П р и и е ч а н и е. (+) - компонент присутствует, (-) - компойент отсутствует,гв в ли ив 2 Количества триптсфана, иг на100 г су хата ве- вества Сорт Относительная электраоаретическвя падвивнасть Оэ 68 О 69 Оэ 70 Ог 71 Оэ 05 Оэ 06 Оэ 07 Оэ 08 Оэ 09 Оэ 10 0,03 0,04 Ов 66 Оэ 67 О, 11 О, 12 О, 13 Местный Льяаяск.абл.Гариэант11 елмнка местнаяГруэняРтензетЗернагралск.мнагапл,уатевРтавеяЕаь 1 е 1 а01 упр 1 енанн чап ВтапОтаана 1 в Нтча 1ГевалНап,ич ттвапП и и е ч в н 200200 210 210 213 222 235 307 315 316 3 З 7 348 355 .375Р и е, + -коэеэонавт присутствует - " компонент отсутствует.Составитель В.ДемкинРедактор М.Недолуженко Техред И.Ходанич Корректор О.Ципле Заказ 670 Тираж 436 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Жв Раушская наб., д, 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г,ужгороц, ул. Гагарина, 101