Способ определения активности 7 -холестерингидроксилазы

(594 С 01 ИЗЗ ГОСУДАРС ТВЕН Н ПО ИЗОБРЕТЕНИ ПРИ ГКНТ СССР И КОМИТЕТ И ОТНРЫТИ ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕ ТЕЛЬСТ РСНОМУ 246275/28-1 47,05.870.04.89. Бюл. Н 16ренбургский медицинсед дл ологии: быть ис 10 Е - ного растворавор помещали в токпока не исчезал может функци икросо именно к биохимииользовано для оцен нально- ального стояния систем й эмуль -стерина в печенитивности фермен окисле т о леевсти ЖС составчете определения ак -холестерингидЦель изобре соба при однов инвазивности.Способ осущ роксил тенияремен зы.упрощение спом снижении его ледующим ествляю в кровь,ой 180 ркозомдили врован 20 под легким ли бедренн ирным ую вену и вво ин-стабилизи холестерина. ливали элек крывали двум ельная актив ость осстанавл ась ле введения рад В,ПТвердохлиб, А .А. НФилиппов, Б.А. Фролов,Афонина и Ф.З. Меерсон612 . 01 5(088 .8)Лопухин 1 О.М., Арчаков Аимиров Ю.А., Каган Э.М,М,: Медицина, 1 983, сСПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТОЛЕСТЕРИНГИДРОКСИЛАЗЫИзобретение относится кможет быть использовано 1Изобретение относится к б разом.1, Приготовление альбумин-стабилизированной эмульсии.250 мкл 7(п)- Н СЬо 1 езего 1 фирмы АшегзЬаш с общей радиоактивностью 250 мкКи, растворенного в толуоле, высушивали в токе азота, затем быстро добавляли 0,5 мл ацетона.Полученный раствор медленно, редкими каплями добавляли при энергичном перемешивании на аппарате типа оценкц функционального состояния микросомального (МК) окисления холестерина в печени. Цель изобретения - упрощение способа при снижении его инвазивности, Для этого экспериментальному животному однократно внутривенно вводят стабилизированную эмульсию Н-холестерина, затем в мочЬ определяют содержание 3Н О-продукта окисления холестерина под влиянием 7холестерингидроксил зы. Изобретение позволяет оценить функциональное состояние МК в сроки, когда реализуются большинство экстремальных воздействий на организм2 табл. Чогех к 17 млальбумина. Растазота до тех пор,запах ацетона.Радиоактивность полученнсии определяли помещая 5 м1 0 мл сцинтилляиионной жидкРадиоактивность эмульсии6ляла 32,51 О имп/мин в рана 1 мл эмульсии.2. Введение радионуклидаУ.крыс линии Вистар масс нее 0,4 мл альбумной эмульсии Нтечение останаагуляцией, рануными швами. Двигживотных полноств течение 1 ч понуклида.3. Сбор мочи для исследования наличия Ъ О.Использовали способ сбора спонтанно выделенной мочи. Для этого животных аккуратно извлекали из клеток .,и помещали на чистую сухую стеклянную поверхность Через 15-20 с наступало самопроизвольное мочеиспускание. Мочу собирали пастеровской пипеткой в мер- О ную пробирку, Процедуру повторяли 3-4 раза через 30-40 мин, добиваясь получения 1-1,5 мл мочи.4. Перегонка мочи, получение дис- тиллята . 5К 1 мл мочи добавлялимл 207-ной ТХУ (трихлоруксусная кислота), встряхивали и подвергали дистилляции в микродистилляторе до получения 0.,4- 0,6 мл воды. 205. Счет радиоактивности дистиллята.Радиоактивность полученнЬй тритиевой воды измеряли на сцентилляционном счетчике .8100 фирмы Весйшап 25 Дпя этого 0,4-0,6 мл дистиллята помещали в 10 мл сцинтилляционной жидкости ЖСи определяли активность сч ета, имп/мин, Радиоактивность тритиевой воды рассчитывали на 1 мл30 мочи.П р и м е р 1. Изучали динамику выведения тритиевой водь 1 с мочой по сле однократного введения животным(белым крысам) 0,4 мл альбумин-стабилизированной эмульсии 7.(п) Ы НСЬо 1 езйего 1 фирмы АшегвЬащ с общей радиоактивностью введенной дозы 6 6 -6Э13" 10 ипм./мл мин около 10-15 мкКи на животное. Полученные данные свидетельствуют о том, что уже через 2 и 4 ч после внутривенного введенияизотопа в моче появляется и быстро нарастает радиоактивность, обусловленная НО. Максимум ее приходитсяз 45 на вторые сутки после введения меч еного холестерина (ЗН-ХС)Затем следует постепенное снижение радиоактивности, отражающее естественную убыль ХС, введенного в организм за счет его гщцроксилирования и других метаболических превращений. Динамика выведения тритиевой воды с мочой прослежена до 16 сут, когда радиоактив- ность мочи составляла 27-31 от максимальной, отмеченной на вторые сутки. Наиболее динамичные изменения отмечены в первые 5-6 дней после введения меченого ХС, т.е. в сроки, когда реализуются большинство экстремальных воздействий на организм. Полученные данные представлены в табл. 1,П р и м е р 2. Изучали скорость окисления холестерина под влиянием эмоционально-болевого стресса. Ди - намика выведения с мочой Н. О отра-. жает скорость ее образования и; следовательно, активность 7-о- холестерингидроксилазы у контрольных животных (и) и крыс, перенесших эмоционально-болевой стресс (п) .Эмоционально-болевой процесс в виде невроза тревоги воспроизводили по стандартной методике Десидерато .(1 974) . Стрессорное воздействие продолжалось 6 ч. Животных брали в опыт через 1 ч после прекращения стрессового воздействия.Полученные результаты представлены в табл. 2.В табл, 2 показана радиоактивностьдистиллята мочи животньй, перенесшихэмоционально-болевой стресс (введено 0,4 мл альбумин-стабилизированной эмульсии Н-холестерина, имп/мин),3Снижение скорости образования Н О отражает стрессорное ингибирование активности 7гидроксилазы ХС в первые 2 сут после стресса. Затем активность постепенно нормализуется.Предлагаемый способ определения уровня гидроксилирования ХС в эксперименте ин виво позволяет наблюдать динамику этого процесса у интактных животных и перенесших экстремальное воздействие, а также позволяет оце-. нить защитный эффект химических мембранопротекторов и адаптационных способов защиты биологических мембран печени. Способ может быть использован для изучения и прогнозирования процесса атерогенеза.В сравнении с известным предлагаемый способ обеспечивает упрощение и неинвазивность за счет отсутствия необходимости отбора крови. Формула изобретенияСпособ определения активности 7-О-холестерингидроксилазы путем введения экспериментальному животному меченого Н-холестерина с после3дующим отбором и исследованием биологической жидкости на содержание 3Н О, о т л и ч а ю щ и й с я тем,147 б 380 6эмульсию Э Н-холестерина, которуювводят внутривенно однократно, а вкачестве биологической жидкости используют мочу.Таблица 1 что, с целью упрощЕния способа приодновременном снижении его инвазивности, в качестве источника Н-холестерина используют стабилизированную Радиоактивность дистилляте мочи контрольных хивотных послевведения 0,4 мл алъбумин-стабилизированно 1 эмульсии Н-холестерина(ююпlмин) Радиоактивность, имп/мин Живот" ное Время отбора проб мочи после введения радионуклида 24 ч 48 ч 72 ч 4 сут 5 сут 6 сут 2"4 ч 7 сут 1 2079 . 8026 154814345 1 7 Э 5 12220 Не отби рапи То хе 13114 Не отбирапи99771 603016888180831803916983 2 24332250 28069 22070 и 1113728 3221 15317 11600 М+а 4410,7 12,7+1,5 22,0+2,2 19,5+,3 16,81,23,7+ 3,5+1 13,3+О,бтыс ячнмп/мйн. Таблица 2 Радиоактивность, ев/мин 42 ч 72 ч 4 сут 5 сут Животное Время отбора проб мочи после введения радиоиуклида.11578 . Не отбиралн13161 То ке15864 1 Не отбирали2 29413 Не отбирали 512557974915 7311 16222383613613 "Не отбирапи5974 16897 17747 10333 21896 20267 11 231 13733 18714 6814 3420 13838 9609 4386 13739 9929 7097 20302 8063 15542 15012 14768 15378 20316 15603Не отбирали136 9 43145 5 3145.6 5557 3905 84232 9 39050 2614 21825581122511 2060914420 Не отбирали14552 1237611 029 1142166676333Не отби 6575рели18220 11 58 1 277 5250 1 6046 13824 15037 11573 11 7561 4680 1466 20222 131 92йВэ 40)9 16 ФОф 9 7+016 169+11 14 е 9+Ое 9 14 фЗ+Оэ 5 117+1 е М+а 4 1+0,4тыс ячюв/мин Составитель Н. Гуляева Техред Л.Олийнык Корректор М. Пожо Редактор М. Петрова Заказ 2150/45 Тираж 790 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгородул. Гагарина, 101 3 4 5 б 7 8 2400 3144 Не отбирали6310 6538 71500333 31872 1 0286 24171 11480 1531195 2 2 536 1 2398 1 9659 17617 19496 20568 16714 19063 23872 2078 8958 15150 11969 142241197 14276 12217 1433320000 1 0950 12443 7740 1392 . 1013 3033 12420 1 580 13228 15771 12815