Способ культивирования нервной ткани

.У 4овательский инстиной медицины АМ асов и П;(57) биоло услов зобретение относится медицине и позволяет ьчо получить высокок гии иЯХ )ПЧ чественза срав- вышенным ные кинтел льтуры нервнои ткани но короткий срок с и мещают эмбриональные ганглии, 18 и 20 акрывают я тые о разви ренни зародышеи кр я, Это кольцо кольцом при и ут- сте мощи ильных усло Каждой из омощи эфираиях.0 наркотизи анных при ии Вистар, камеры вной полосной полос- тальные рыс, самцов лин свободно по 2 область брюш енных из брюш плантируют еоцекальнуИз извле камер при епараты, к 0т т отавливают то-орые исследую нейрогистоло п помо щью из методи В иестных еских ходном матер ьтивирования але, использ нейтральные езрелыми не мом дл менты представле ГОСУДАРСТВЕННЫИ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(56) Методы, Техникаводство по к ОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НЕРВНО Изобретение относится к медицине,а именно к экспериментальной и клинической медицине.Цель изобретения - получение высокодифференцированной нервной тканииз эмбриональных зачатков,П р и м е р . Диффузионную камеруготовят следующим образом.На торцовые стенки наружного ивнутреннего колец из оргстекла приклеивают нуклеопоровые фильтры. Изготовленные таким образом половинкидиффузионных камер стерилизуют, проверяют на герметичность, обрабатывают ультрафиолетом На внутреннюю поверхность филь тра наружного кольца в каплекультуральной среды (1,99 или Хенкса) выходом зрелых нейронов и глиальныхклеток. С целью получения высокодифференцированной нервной ткани изэмбриональных зачатков закладки эмбриональных нейральных тканей помещают на нуклеопоровые фильтры, из которых изготовлены диффузионные камеры.Диффузионнье камеры после герметизации имплантируются свободно в илеоцекальную область брюшной полостикрыс-рецепиентов сроком до 20 сут.Предлагаемый способ может быть использован в экспериментальной нейро-биологии для изучения закономерностей гистогенеза и в клинической практике для лечения ряда дистрофическихзаболеваний, связанных с дефицитомнейромедиаторных и нейроэндокринныхсостояний.1454838 ре и состоит, в основном из мигрирующих тяжей и пластов леммоцитов с заключенными в них новообразующимисяи регенерирующими отростками нервныхклеток. На периАерии трансплантатаглиальные клетки образуют монослойнуювыстилку из полигональных клеток. Наповерхности этой выстилки находятся 10 простирающиеся на большом протяжении тяжи веретенообразных леммоцитов,формирующих сложную трехмерную сеть.В тяжах, расположенных ближе к центру, леммоциты располагаются в несколь ко пучков, плотно прилегающих другк другу, а по мере удаления к перифе"рии тяжи делятся на более тонкиеветви, выстраиваются в один ряд, образуя характерные цепочки из верете нообразных клеток, соединяющихсясвоими отростками, Длина отдельныхклеток составляет 20-40 мкм, Наиболее диАференцированные,леммоциты находятся в центральной и промежуточной 25 зонах, а менее дифференцированныена периферии эксплантата и у самойего поверхности. Растущие в теснойсвязи с леммоцитами аксоны повторяютвесь сложный путь образуемых этими 30 клетками сетей и за пределы их невыходят. Аксоны, растущие по цепочкамлеммоцитов, заканчиваются, как правило, конусами роста на терминальнойодноядерной клетке. На ранних сроках З 5 в тяжах леммоцитов выявляются тонкиепучки безмякотных аксонов (от 3 до). Через 8-12 сут после трансплантации уже встречаются вполне дифференцированные нервные волокна с диа 40 ного онтогенеза. 45 бластами и молодыми нейронами, Клетки эти имеют крупное ядро с двумя ядрышкамии, небольшой объем цитоплазмы, а у некоторых выявляется и один тонкий безмякотныйотросток. Между нейробластами находятся немногочислен ные сателлиты, некоторые из которых осуществляют митотическое деление.Через 7 сут после трансплантации на нуклеопоровых Аильтрах, также как и в культурах п чдго, отчетливо видны две зоны: 1 - центральная, представленная нейронами чувствительных ганглиев, которые, как правило, не мигрируют, и 2 - зона роста, состоящая из леммоцитов и сателлитов.Нейтроны в центральной зоне располагаются разрежено и количество их по сравнению с исходным материалом уменьшается. Нервные клетки имеют разнообразную Форму тела; округлую, многоугольную, веретенообразную, неправильную, Часть нейронов , прилегающих к зоне роста, приобретает вытянутый вид, причем продольная ось их тела совпадает с направлением миграции тяжей леммоцитов из центра ганглия. В процессе диААеренцировки нейронов увеличиваются размеры их тела: если исходный эмбриональный материал содержит только нейробласты диаметром 155 мкм, то в 7-суточных трансплантатах уже встречаются округлые нейроны (4550 мкм) и вытянутые (от 1540 до 2555 мкм). 0 степени дифференцировки нервных клеток свидетельствует не только Аормирование в их цитоплазме хроматоАильного вещества, но и увеличение числа и диаметра образующихся отростков. В восьмисуточных имплантатах обнаружены нейроны трех типов: уни , бии мультиполярные. Наиболыяий процент составляют мультиполярные нейроны,а .наименьший - псевдоуниполярные нейроны, столь характерные для нормального организма. Нейроны снабжены хорошо развитыми ветвящимися отростками, которые следуют от центра ганглия к периферии, образуя там широкопетлистое нервное сплетение. Наиболее плотное сплетение нервных волокон наблюдается в центральной зоне между нейронами.Зона роста, располагающаяся от1 центра ганглия к периферии, занимаетобширную площадь до 4-6 мм в диаметметром аксона 1-2 мкм и интернадальным сегментом 100-250 мкм. Такие леммоцит-аксонные взаимоотношения очень сходны со стадией предмиелинизации нервного волокна в процессе нормальПолученные результаты свидетельствуют о том, что в нуклеопоровыхдиффузионных камерах нейробласты не 50-только сохраняют свою жизнеспособность, но и дифференцируются в зрелые.нейроны с присущими им описаннымигистотипическими особенностями.Для сравнения качества выходазрелой нервной ткани в различноготипа диффузионных камерах.все те жепроцедуры были проделаны и на миллиопоровых фильтрах. В миллиопоровыхдиффузионных камерах через 7 сут посСоставитель М. ПознякТехред М.Ходанич Корректор О.Кундрик Редактор Н.Киштулинец Заказ 7410/29 Тираж 500 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4 5 1454838 6ле имплантации обиаруживали, как пра- в друга колец из биологически активно вило, только погибшие нейроны и гли- го материала, торцовые стенки которой альные клетки. выполнены из фильтров, о т л и ч а -ю щ и й с я тем, что, с целью полу- Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я чения высокодифференцированной нерв ной ткани из эмбриональных зачатков,Способ культивирования нервной в качестве фильтров используют нуклеоткани Ы чиччо в диффузионной камере, поровые, а камеру имплантируют свосостоящей из двух, вставленных друг 10 бодно в брюшную полость животного.