Способ определения активности фосфолипазы а

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК а 01 ЫЗ 34 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФОСФОЛИПАЗЫ А,(57) Изобретение относится к способамопределения активности липолитических ферментов, предназначено для микробиологической промышленности, биотехнологии, биофизики, биохимии, энзимологии. Цель изобретения - повышение чувствительности и 801416918 А 1 упрощение способа определения активности фосфолипазы А 2. Для этого берут кювету с 2 отделениями, разделенными перегородкой (отверстие в перегородкеф 0,9 мм ), и заполняют р-рами следующего состава, мас.%: трис-НС 0,121; КС 0,745; СаС 2 0,011; остальное - дистиллированная вода, рН 8,1. Затем отверстие закрывают азолектиновой бислойной липидной мембраной (БЛМ) из 2%-ного р-ра азолектина в декане путем отбора 0,005 р-ра азолектина на пробу. Фосфолипазу А. добавляют в оба отделения кюветы и определяют время жизни азолекти новой БЛМ (время регистрации электрического сопротивления БЛМ от момента добавления фосфолипазы А в обаРЩ отделения кюветы до разрыва мембраны). Я 1 ил.Изобретение относится к способам определения активности липолитических фермен. тов и может быть применено в био. технологии, микробиологической промышленности, биофизике, биохимии, энзимологии,Целью изобретения является повышение чувствительности и упрощение способа определения активности фосфолипазы А.Пример 1. Берут кювету с двумя отделениями, разделенными перегоролкой (с отверстием в ней диаметром О 9 мм) и заполненными раствором слелующего состава, мас.Я: трис - НС 0,121; КС 0,745; СаС. 0,011; дистиллированная вода - остальное рН 8,1. Затем на отверстии формируют азолектиновую бислойную липидную мембрану (БЛМ) из 2 Я.ного раствора азолектина в декане путем отбора 0,005 мл раствора азолектина на пробу. Фосфолипазу А, добавляют в оба отделения кюветы и определяют время жизни азолектиновой БЛМ (время регистрации электрического сопротивления БЛМ от момента добавления фосфолипазы А в оба отделения кюветы до разрыва мембраны) при воздействии на нее фосфолипазы А, оно составляет=24,8 мин (Кнзч - электрическое сопротивление БЛМ - составляет 2,5 х Х 10 Ом). Получают концентрацию (ак. тивность) фосфолипазы А, равную 1,8 Х 10 г/мл (см. чертеж, кривая А).Пример 2, Берут кювету с двумя отделениями и дальше все операции проде. лывают, как в примере 1. Диаметр отверстия 1,0 мм. Состав инкубационного раст. вора, мас.Я: трис-НС 1 0,121 КС 1 0,745; СаС 1 0,001; дистиллированная вода - остальное рН 8,0. Фосфатидилхолиновую БЛМ формируют нз 2 г-ного раствора яичного фосфатидилхолина в декане, нанося на отверстие раствор фосфатилилхолина в количестве 0,003 мл на пробу. Добавляют фосфолипазу А в отделения кюветы и определяют время жизни фосфатидилхолиновой БЛМ при воздействии на мембрану фосфолипазы А оно составляет 70 мннФормула изобретения Способ определения активности фосфоли.пазы Аь включающий формирование фосфолипидной мембраны, инкубацию ее в роде, содержащей хлористый калий, буферный растфор и ионы СА+- при рН 8,0 в присутствии раствора фосфолипазы А определенной концентрации с последующим изме. З 0 рением активности, отличающийся тем, что,с целью повышения чувствительности способа и его упрощения, формируют плоскую бислойную мембрану на отверстии диаметром 0,9 - 1,0 мм, в разделяющей перегородке кюветы, сорстоящей из двух отсеков.35 путем нанесения 1,9 - 2,0 мас.,г растворафосфолипидов в декане, инкубацию проводят в среде, содержащей 0,74 - 0,745 мас.Я хлористого калия и 0.001 - 0,011 мас, Я хлористого кальция, причем средой инкуоации заполняют оба отсека кюветы, а актив ность определяют по времени жизни мембраны, регистрируя ее электрическое сопротивление. 5101520 г(К" .=10" Ом). Получают концентрацию (активность) фосфолипазы А, равкую 5,6 10 " г/мл (см, чертеж, кривая Б),Пример 3, Берут кювету с двумя отделениями и дальше все операции проделывают, как в примере 1. Диаметр отверстия 1,0 мм. Состав инкубационного раствора, мас.Я трис-НС 0,121; КС 1 0,745; СаС 1,0,001; дистиллированная вода - остальное, рН 8,0. Фосфатидилэтаноламиновую БЛМ формируют из 2 Я-ного раствора бактериального фосфатидилэтаноламина в декане, нанося на отверстие раствор фосфатидиэтаноламина в количестве 0,003 мл на пробу. Добавляют фосфолипазу А в отделения кюветы и определяют время жизни фосфатидилэтаноламиновой БЛМ при воздействии на мембрану фосфолипазы А, оно составляет 52,5 мин (Кнац=10 и Ом). Получают концентрацию (активность) фосфолипазы А, равную 5,6 10г/мл (см. чертеж, кривая В).146918 Составитедп,Текред И. Вереираж 847итета СССР поЖ 35, Раушское предприятп Реда кто Заки 4 р М. ЦиткинаОб(43 ТИ Государственного кв113035, Москва,одственно.подиграфичес В 11 И дс.;пи напор,:. а 51 па 5., г. Ужгород,ропп Ж 7 И 7 жГЫли,УуЛЫ 7 77 аГ 7 ЮЫ 777 Ю 7777 Р 7,К . Ж,Ю