Способ определения размера клеток

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РАЗМЕРА КЛЕТОК(57) Для пов ления клетки ную среду, гликоль. Опре ,помпения клет огниССР ние омл ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИИ К АВТОРСКОМУ СВ(71) Институт биохимии и физиолрастений и микроорганизмов АН Си Саратовский государственный университет им,Н.Г.Чернышевского(56) Кленин В.И. и др. Определеотносительного показателя прелния, размеров и концентрации зритцитов по спектру мутности, - Биофизика, 1978, т. 23, У 4, 658-663. ышения точности опредепомещают в инкубациондобавляют полиэтиленделяют показатель преок и фотометрируют.Изобретение относится к биологиии медицине и может быть использованодля определения размера животных имикробных клеток, морфологическогопоказателя физиологического состояния клеток,Целью изобретения является повышение точности определения размеровразличных видов микробных и животных 10Клеток,Указанная цель достигается тем,что клетки помещают в инкубационнуюсреду, вводят стабилизирующую добавку с последующим Фотометрированием, 15в качестве добавки используют полиэтиленгликоль и дополнительно определяют показатель преломления клеток.Способ осуществляется следующимобразом. 20Приготавливают инкубационную среду растворением необходимых минеральных солей для поддержания РН и изотоничности среды. В зависимости от вида клеток и условий эксперимента концентрацию солей и РН среды могут варьировать. В инкубационную среду вносятнавеску полиэтиленгликоля и перемешивают до полного растворения полимера. Концентрацию полиэтиленгликоляувеличивают до тех пор, пока показатель преломления среды не достигнет значения 1,38-1,4. Из исходногоконцентрированного раствора приготавливают разведением серию растворовс показателем преломления 1,33-1,4 сградиентом показателя преломленияпримерно 0,01, Таким образом получают,ряд из 5-6 значений показателяпреломления р, рРде 40показатель преломления инкуба-,ционной среды без добавок полиэтилен -гликоля. Показатели преломления средизмеряют на рефлектомегре, В пробиркудозируют постоянный объем среды с оп 4 Вределенным значением показателя преломления. В каждую пробирку вносятодинаковые концентрации клеток и тщательно перемешивают до полного диспергирования клеток в среду, Суспензию переносят в кювету спектрофотометра и измеряют спектральную зависимость оптической плотности. Из спектральной зависимости оптической плотности определяют волновой экспоненти для каждого, По определенномуСри дляиз графика или таблицы и==и(у) находят параметр у. Далее иззависимости ф от показателя преломления среды р, экстраполяцией прямой до пересечения с осью абсцисс получают значение показателя преломления клетки ,. Найденные параметры р и , подставляют в формулу и вычисляют размер клетки;я 3 4 Т(,и,(тп) ф где г - радиус клетки;- длина волны светаш - относительный показатель преломления,ш = Рк 7 йоП р и м е р 1. Определение размеров,црожжевых клеток ЯсгозасЬагашусез сресез.Клетки выращивают на агаризованном сусле 48 ч, дважды отмывают физиологическим раствором, Готовят инкубационную среду растворением полиэтиленгликоля (молекулярная масса 20 тыс.) в 0 15 М ИаС 1 забуференном ацетатным буфером до РН 4,8 (оптимальное значение РН жизнедеятельности клеток данного штампа). Показатель преломления данной среды составлял 1,384. Из исходного концентрированного раствора готовят разведением в забуференном 0,15 М БаС 1 растворы с показателями преломления 1,353, 1,357, 1,363, 1,373, Показатель преломления инкубационной среды без полиэтиленгликоля . 1,334. Измерения показателей преломления сред проводят на рефлектометре ИРФ, В пробирки дозируют по 2 мл среды с определенным значением показателя преломления. В каждую пробирку вносят по 0,2 мл концентрированной суспензии и тщательно перемешивают, Полученные суспензии переносят в оптическую кювету длиной 1 см и измеряют на спектрофотометре СФзависимость оптической плотности от длины волны в дитапазоне длин волн 400-600 нм. По измеренным данным строят графики 1 яП, из наклона полученных прямых определяют волновой экспонент п для каждого значения к . Для р волносрвой экспонент составлял 0,98. Далееииз построения Й - л экстраполяциейсрпрямой до пересечения с осью абсцисс получают значение показателя преломления клетки ц=1,404, Определив вычисляют относительный показатель преломления клетки ш=1,404/1,334=Составитель Е.КолмаковаТехред И.Верес Редактор М.Циткина Корректор И,Муска Тираж 775 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Подписное Производственно-полиграфическое предприятие, г,ужгород, ул.Проектная,4 з 13 =1,05, Из графика п=п(Р) для в=1,05 находим параметр р . При п=0,98 иско" .мая величина р=2,95. Подставив найденные параметры р и ш в формулу (1), получаем радиус клетки г=1,7 мкм.П р и м е р 2. Определение размеров микробных клеток.В эксперименте использовали 24-часовую культуру, выращенную на жидкой минеральной среде. Клетки дважды отмывали физиологическим раствором, Готовили инкубационную среду растворением полиэтиленгликоля в трис-буфере рН 7,4. Дальнейшие действия по приготовлению ряда инкубационных сред с различным значением показателей преломления, приготовлению суспензии клеток, фотометрированию и т,д, аналогичны примеру 1.В среде с р =1,334 волновой экспонент был равен 2. Показатель преломления клеток .со 1 х =1,38, относительный показатель преломления ш=1,03, параметр р =0,7. Отсюда размер клеток 0,68 мкм.П р и м е р 3, Определение размеров эритроцитов человека.Эритроциты трижды отмывали физиологическим раствором от белков плаз 373494мы, Готовили инкубационную среду раст.ворением полиэтиленгликоля в фосфатном буфере с рН 7,2, Дальнейшие действия аналогичны примерам 1 и 2 заисключением выбора спектрального диапазона. В связи с наличием полоспоглощения при 3 ( 600 нм гемоглобином эритроцитов, измерения оптической плотности проводились в диапазоне 600-900 нм. В среде с ц =1,334 п=0,3. Показатель преломления эритроцитов 1,42, 15 относительный показатель преломления1,07, параметр у 3,7. Отсюда размеры эритроцитов 2,3 мкм . Формула изобретения20 Способ определения размера клетокпутем помещения клеток в инкубационную среду, введения стабилизирующейдобавки с последующим фотометрирова нием, о т л и ч а ю щ и й с я . тем,что, с целью повышения точности оп 1ределения в качестве добавки испольФзуют полиэтиленгликоль и дополни-тельно определяют показатель прелом:ления клеток.