Способ идентификации фрагментов мембран хлоропластов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 1193580 С 01 Н 33/О ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ, АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ л ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(46) 23.11.85. Бюл. У 43 (71) Институт фотобиологии АН БССР (72) А.А. Шлык и М.С. Радюк (53) 581.174.1(088.8)(56) Махер Г, Кордес Ю, Основы бигической химии. М.: Мир, 1970,Атийгеп С. д ., 0 Иеу К.А. ,7. Сей. Вдо., 43, 16, 1969. (54) (57) СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ФРА МЕНТОВ МЕМБРАН ХЛОРОПЛАСТОВ, включающий фрагментирование мембран с помощью детергента, фракциониро нне и концентрирование анализируемых фрагментов, электронно-микроскопический анализ фракций, о т -л и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью повышения точности и ускорения идентификации, сконцентрированные фрагменты промывают фосфатнымбуфером рН 7,0-8,0 для созданияусловий агрегации фрагментов мембранво вторичные мембраноподобные структуры, а идентификацию фрагментовосуществляют по присутствию на ихповерхности частиц сопрягающегофактора.Изобретение относится к фотобиологии, а именно к способам идентификации фрагментов мембран хлоропластов для установления их происхождения из межгранных или гранальных тилакоидов, и может быть использовано при изучении механизма фотосинтеза растений,Цель изобретения - ускорение идентификации и повышение точностианализа фрагментов мембран хлоропластов.Способ осуществляется следующимобразом.Изолированные хлоропласты из листьев растений фрагментируют с помощью детергентов (например, диги-. тонина, тритона Хи т.д.). Материал фрагментированных мембран хлоропластов фракционируют, например, дифференциальным центрифуги-рованием. Полученные, в данном случае, в виде осадков фракции фрагментов мембран промывают в течение .2-3 ч при 0-4 С 2-3 сменами чистого (без детергента) фосфатного буфера, рН 7,0-8,0, что является достаточным для практически полного. удаления детергента из осадка, тогда как однократная промывка недостаточна для этой цели.После этого осадки фрагментов мембран фиксируют 1-ЗХ-ным раствором глютарового альдегида в течение 1-2 ч, постфиксируют 1-2 Е-ным раствором 00 тоже в течение 1-2 ч, после чего обрабатывают 0,5-17.-ным раствором уранилацетатав течение 12- 16 ч. Обработанный таким образом материал обезвоживают спиртом и ацетоном и заключают в эпон. Срезы залитых в эпоновые блоки осадков контрастируют уранилацетатом и цитратом свинца и просматривают под электронным микроскопом, устанавливая присутствие или отсутствие частиц сопрягающего фактора на поверхности вторичных мембраноподобных структур.П р и м е р 1. Изолированные хлоропласты ячменя, фрагментируют О,ЗЖ-ным раствором дигитонина в 0,02 М фосфатном буфере (рН 7,2) в течение 20 мин и фракционируют по,лученный материал с помощью дифференциального центрифугирования на фракции, осаждаемые при 20 тыс. в течение 30 мин, затем при 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 50 тыс.в,течение 30 мин, при100 тыс. Ч в течение 30 мин ипри 144 тыс.в течение 60 мин.Полученные осадки промывают в течение 3 ч тремя сменами (по 10 мл)чистого фосфатного буфера. Все перечисленные операции проводят при0-4 С, Отмытые отдигитонина осадоки фиксируют 27-ным глютаровымальдегидом в течение 1 ч, постфиксируют 27-ным раствором 00 тожев течение 1 ч, затем обрабатывают17.-ным раствором уранилацетата втечение 12 ч, обезвоживают спиртоми ацетоном и заключают в эпон. Срезы залитых в эпоновые блоки осадков прокрашивают 17.-ным растворомуранилацетата и цитратом свинца,после чего их просматривают и фотографируют на электронном микроскопе,устанавливая присутствие или отсутствие структурных элементоводиаметром 100 А на поверхностивторичных мембраноподобных структур.П р и м е р 2. Материал обрабатывают аналогично примеру 1 заисключением того, что полученныеосадки промывают одной сменой Фосфатного буфера. Этого недостаточнодля формирования из фрагментовмембран четких мембраноподобныхструктур, т.е. на электронномикроскопических изображениях не видночетких мембраноподобных структур.П р и м е р 3, Материал обрабатывают таким же образом как в примере 1, за исключением того, что полученные осадки не промывают фосфатным буфером, а сразу Фиксируютглютаровым альдегидом, В этом случае вторичные мембраноподобные структуры из фрагментов мембран хлоропластов не образуются,П р и м е р 4. Материал обрабатывают таким же образом. как в примере 1, за исключением того, чтополученные осадки промывают фосфатным буфером, рН которого не 7,2, а7,0, При таких условиях имеет местообразование вторичных мембраноподобных структур из фрагментов мембранхлоропластов,П р и м е р 5. Материал обрабатывают таким же образом как в примере 1, за исключением того, чтополученные осадки промывают фосфатным буфером, рН которого 8,0. Притаких условиях наблюдается образо1193580 Составитель М.МирзаевТехред С.Мигунова Корректор М.Максимишинец Редактор А,Шандор Тираж 896 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий И 3035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Заказ 8284 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 вание вторичных мембраноподобных структур, однако они имеют несколько нечеткий вид.Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает достоверность анализа фракций и значительно облегчает его, так как позволяет определить исходную локализацию материала фрагментированных мембран хлоропластов в нативных межгранных и гранальных тилакоидах при прямом визуальномнаблюдении (или фотографировании) подэлектронным микроскопом.Причем вместо характерного для5 известного решения технически сложного и сравнительно редкодоступногово многих лабораториях приготовления препаратов криоскалыванием используют обычный метод ультратон ких срезов.