Способ разделения смеси фитогормонов

Взамен ранее изданног СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 01164598 1 Н ЗЗ/48 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ЕЛЬСТВУ АВТОРСКОМ,Ф Св В 32огии и биохимии др. Методы опрев, ингибиторов и гербицидов, М. ФИТОГОР(54) СПОСОБ РАМОНОВ.не, точнееразделения фищих процессыорганизмовЦель изобреи повышение т НИЯ к медици ения и гулируюия микро растений е способ ения. Дл тение относитс к способам пол огормонов,оста и разв высшихскоре низши тения аФ ти разд ч ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬПИИ(21) 3547649/28-14 (22) 26.01.83 (46) 30,08.87, Бюл (71) Институт физи растений АН МССР (72) И,И.Гаврилюк (53) 612.396,1(088 (56) КеФели В,И. и деления фитогормон. роста, дефолиантов Наука, 1973, с. 7 этого в качестве хроматографического слоя применяют смесь целлюлозы, сефадекса 6-25,силикагеля с люминесцен" тным индикатором УФ и крахмала, в соотношении (63-76):(10-19):(10-14): :(5-8) (мас. Ж), Хроматографию фитоогормонов проводят при 20-22 С, используя подкисленный 807-ный водный этанольный раствор свидетелей. Хроматографию проводят в герметической стеклянной камере. Для разделения кинетика, индолилуксусной, .гибберелловой и абсцизовой кислот подобрана система растворителей: н-бутанол, пропанол, аммиак, вода в соотношении (28-32):(47-57):(5-7):(10-14) (об.Ж). Для качественного определения фитогормонов слой адсорбента обрабатывают 0,004-0,0053-ным водным раствором флуоресцеина, парами брома и освещ ют ультрафиолетовым светом. 1 табл11645 Растворитель:н-бутанол, пропанол, аммиак,вода (28:57:5:10об, Ж) Соединения Индолилуксуснаякислота 0,41 Гибберелловая кислота 0,51 Абсцизовая кислота 0,65 0,77 Кинетин Изобретение относится к области медицины, а именно, к способам получения и разделения фитогормонов регулирующих процессы роста и развития5 микроорганизмов, низших и высших растений.Целью предложения является ускорение способа и повышение точности разделения. 10П р и м е р 1. В качестве хроматографического слоя применяют смесь целлюлозы, сефадекса .6-25, силикагеля с люминесцентным индикатором УФ и крахмала в соотношении 63: 15 г 15 :14:8 (мас,Е). Сефадекс, силикагель, крахмал и целлюлозу последовательно в отдельности суспендируют в деиониэированной воде (на 15 г смеси берут 60 мл воды). После суспендирования 20 каждого компонента смеси суспензию размешивают 1 мин. Указанное количество адсорбента достаточно для приготовления 10 пластинок. Для приготовления пластинок со слоем комбини рованного адсорбента используют стек-. лянные обезжиренные фотопластинки (23,7 х 8,7 см). Полученную сорбционную массу наливают на.пластинки и сушат в строго горизонтальном поло жении на воздухе не менее 3 ч. Получают слой толщиной 100 мк. Пласотикки активируют при 90 Св течение 15 ч. Хроматографию фитогормонов прооводят при 20-22 С. Растворы наносят микрошприцом. Для хроматографирования фитогормонов используют подкисленный 807-ный водный этанольный раствор свидетелей (из расчета 0,5 мл НС 1 на 10 мл спирта). На пластинку 40 наносят пробы различных количеств смеси, по 1-3 мкл раствора, содержащего от 17 до 64,5 мкг фитогормонов. После нанесения растворов стартовую линию подсушивают феном в те чение 2-3 мин.Хроматографию проводят в герметической стеклянной камере размером 150 х 150 х 200 мм, Расход растворителя составляет примерно 80 мл, Для 50 разделения кинетина, индолилуксусной гибберелловой и абсцизовой кислот подобрана система растворителей н-бутанол, пропанол, аммиак, вода в соотношении 28:57:5:10 об.7Систему растворителей пропускали восходящим током при подъеме ее на 21 см от линии старта. Разделение фитогормонов на комбинированном ад 98 гсорбенте происходит за 2,5 ч. Хрома-, тограмму подсушивают феном и выветривают до исчезновения запаха растворителя. Для качественного опреде-. ления фитогормонов используют комбинированный проявитель - слой опрыскивают 0,0053-ным водным раствором флуоресцеина, сушат 2 мин феном, действуют парами брома, освещают ультрафиолетовым светом. Фитогормоны на таких хроматограммах сильно поглощают ультрафиолетовый свет и принимают темно-фиолетовую окраску. Значения В. фитогормонов на комбинированном адсорбенте приведены в табл.Значения К (х 100) фитогормонов на комбинированном адсорбенте П р и м е р 2., Свежесобранный растительный материал неоднократно экстрагируют подкисленным 803-ным метиловым спиртом (из расчета 0,5 мл на О, 1 Н НС 1 на 100 мп спирта) . Растительную вытяжку упаривают до небольшого объема. На готовые пластинки диаметром 23,7 х 8,7 см, покрытие комбинированным адсорбентом (целлюлоза - 69,5, сефадекс - 12,5; силикагель - 11,5, крахмал - 6,5 мас. 7), микрошприцом наносят одновременно на стартовую линию растворы анализируемых образцов и свидетелей. Объемы нанесенных растворов равняются 1 5 мкл, что является оптимальными объемами.Отдельно готовят два раствора свидетелей с различным процентным содержанием фитогормонов. Первая смесьЗаказ 3987/3 Тираж 776 , ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 свидетелей объемом 1 мкл содержит 17 мкг (1 мкг индолилуксусной кислоты, по 4 мкг гибберелловой и абсцизовой кислоты, 8 мкг кинетина). Вторая смесь свидетелей объемом 1 мкл содержит соответственно 34 мкг фито- гормонов (2 мкг индолилуксусной, по 8 мкг гибберелловой и абсцизовой кислот, .16 мкг кинетина).Хроматографию проводят в герметичной стеклянной камере, После разделения в системе растворителей: н-бутанола, пропанола, аммиака и воды СЗО:52:6:12 об.Ж) и проявления пятен на пластинке в принятых условиях проводят количественный анализ фитогормонов. Для этого используют алгебраический метод Пурди и Трутера, основанный на зависимости между площадью пятна и его массой. В тычинках цветков яблони этим методом обнаруживают на 3 г сырого материала 5 мкг индолилуксусной, 3 мкг гибберелловой кислоты, 2 мкг кинетина и три не- идентифицированных цитокининаП р и м е р 3, 2 г лиофилизированных трехдневных проростков пшеницы экстрагируют подкисленным 803-ным метиловым спиртом (О, 1 л, 3 ч при 20 С). Спиртовой экстракт отделяют от осадка и упаривают досуха, остаток растворяют в 2 мл 953-ного этилового спирта. На пластинку, покры- тую комбинированным адсорбентом; целлюлозой, сефадексом 6-25, силикагелем с люминесцентным индикатором УФ,д и крахмалом в соотношении 76: 10:9:5 мас,7, наносят исследуемый и эталонный растворы. Разделение проводят на комбинированном адсорбенте в системе н-бутанол, пропанол, аммиак, вода в соотношении 32:47:7:14 об.7. После проявленияпятен 0,0057.-ным водным растворомфлуоресцеина на пластинке проводяткачественный анализ фитогормоновВпроростках пшеницы обнаружены гибберелловая и индолилуксусная кислоты,а также вещество цитокининовой природы,10 Использование способа позволяетв 18-20 раз ускорить процесс разделения при большей четкости деления. Формула изобретения15 Способ разделения смеси фитогормонов, включающий нанесение смеси наадсорбент с последующим разделениемв системе растворителей и проявле 20 нием в ультрафиолетовом свете, о т -л и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью ускорения способа и повышенияточности разделения, в качестве адсорбента используют смесь целлюлозы,25 сефадексй, силикагеля с люминесцентным индикатором УФ и крахмала присоотношении ингредиентов, мас. Х:Целлюлоза 63-76Сефадекс 10-1530 Силикагель 9-14Крахмал 5-8а система растворителей включаетн-ВцОН, пропанол, аммиак и воду присоотношении, об. Е:н-ВРОН28-32Пропанол 47-57Аммиак 5-7Вода 10-14,причем для проявления компонентов40 слой адсорбента обрабатывают водным .раствором флуоресцеина с концентрацией 0,004-0,005 мас. Х, а затем парами брома.