Способ получения ганглиозидов

енникосследоститут 20760алог).энды: вдова 975,ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТЫ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Волгоградский научновательский противочумный и (53) 616.07(088.8)(56) 1. Патент Франции Р 2 кл. А 61 К 35/30, 1977 (ан2. Свеннерхольм. Гангли деление, В кн. Методы иссл ния углеводов. М., "Мир", с. 348-352 (прототип).(54)(57 ДОВ пут ткани, о вания см ким рас сткой ц ч а ю щ ускорен смесью очистку ацетона СПОСОБ П м гомоген безвожива есью хлор ворителем левого пр и й с я т я способа лороформа проводят в соотнош ЛУЧЕНИЯ ГАНГЛИОЭИэации моэговойи ее, экстрагироформа с органичесс последующей очидукта, о т л им, что, с цельюэкстракцию ведутс этанолом, аобавлением к пробнии 5:1 .10 П р и м е р 1. В качестве источника получения ганглиозидов используют головной мозг свиньи. Отделяют серое вещество головного мозга от беИзобретение относится к медицине,в частности к биохимии.Известен способ выделения ганглиозидов, включающий экстрагированиеганглиозидов из нервных .тканей млекопитающих тетрагидрофураном с последующим пропусканием экстракта через хроматографическую колонку и выделение осадка,.который растворяютв воде, диализуют и сушат сублимацией 13,Известен также способ полученияганглиозидов по Свеннерхольму, включающий обезвоживание нервной тканиацетоном, последующее ее экстрагирование смесью хлороформ-метанол с 15многократным фракционированием, включающим в себя 18 этапов 121.Целью изобретения является ускорение и повышение безопасности способа.20Укаэанная цель. достигается тем,что согласно способу, получения ганглиозидов путем гомогенизации мозговой ткани, обезвоживание ее, экстрагирования смесью хлороформа с органическим растворителем с последующей очисткой целевого продукта, экстракцию ведут смесью хлороформа сэтанолом, а очистку проводят добавлением к пробе ацетона в соотношении5:1.Способ осуществляют следующимобразом.Отделяют серое вещество головногомозга от белого. Серое вещество гомогенизируют с ацетоном иэ расчета4 мл на 1 г исходной ткани. Затемнепрерывно перемешивают в течение12-20 ч и фильтруют суспензию на воронке Бюхнера, Осадок опять суспендируют в ацетоне из расчета 2 мл 40на 1 г ткани, перемешивают в течение4 ч при 20 С и повторно фильтруют наворонке Бюхнера.Полученный осадок дважды экстраги.руют смесью хлороформ-этанол (1:11 45из расчета 2 мл на 1 г исходной ткани, В течение 1 ч встряхивают нашуттеле и центрифугируют. Супернатанты собирают, а осадок опять экстрагируют смесью хлороформ-этанол (1:1) 50из расчета 1 мл на 1 г исходной ткани. Эту суспензию нагревают на водяной бане 30 мин при 50 фС и центрифугируют в горячем виде. Супернатан-ты объединяют, 55Добавляют к полученному экстракту 5 объемов ацетона. Смесь ганглиозидов выпадает в осадок, После полного Формирования осадка (через 3040 мин супернатант отсасывают сифоном, а смесь ганглиозидов собирают,лого. Серое вещество в количестве1000 г гомогенизируют в 4000 млацетона, затем непрерывно перемешивают в течение 12 ч при 20 фС и суспензию фильтруют на воронке Бюхнера.Ос."док вновь суспендируют в 2000 мяацетона и перемешивают в течение4 ч при 20 ф С и повторно фильтруютна воронке Бюхнера.Для извлечения ганглиоэидов полученный осадок экстрагируют 2000 мпсмеси хлороформ-этанол(1:11 путемвстряхивания на шуттеле в течение1 ч при 20 фС. Супернатант. собирают,а осадок вновь экстрагируют 1000 мпэтой же смесью органических растворителей при 50 С в течение 30 мин ицентрифугируют при данной температуре. Полученные супернатанты объединяют н для осаждения ганглиозидовдобавляют к ним 5 объемов 15000 мл 1ацетона. После полного Формированияосадка (через 30-40 мин 1 супернатантотсасывают сифоном, а осадок, представляющий собой смесь различныхганглиозидов, окончательно освобождают от супернатанта центрифугированием.Полученный препарат ганглиозидовсодержит 395 + 17 мг Б-ацетилнейраминовой кислоты, определяемой с помощью резорцинового реактива, и6122500 51500 токсиннейтрализующихединиц, выявляемых в тесте нейтрализации биологического действияхолерогена в кожной пробе по методу"Крейга. В надосадочной жидкости,полученной после осаждения препарата ацетоном, ганглиозиды не обнаруживаются.П р и м е р 2. В качестве источника получения ганглиозидов используют головной мозг свиньи. Конкретное осуществление способа проводят,как описано в примере 1, испольэуядля осаждения ганглиозидов вместо 5объемов ацетона 4 объема, что приводит к частичному выпадению ганглнозидов в осадок, Полученный препаратганглиозидов содержит 21113,5 мгИ-ацетилнейраминовой кислоты, определяемой с помошьв резорцинового реактива, и 387200032500 токсиннейтрализующих единиц, выявляемых в тесте нейтрализации биологического действия холерогена в кожной пробе пометоду Крейга. В надосадочной жидкости, полученной после осажденияпрепарата ацетоном, обнаруживаютсяганглиозиды, полностью осадить которые удается путем добавления краствору ацетона до 5 объемов,П р и м е р 3. В качестве источника получения ганглиозидов используют головной мозг свиньи. Конкретное осуществление способа проводят,как описано в примере 1, используя для осаждения ганглиозидов вмесЗаказ 6613/37 Тираж 822 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП"Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 то 5 объемов ацетона 6 объемов, что не обеспечивает дополнительного осаждения ганглиоэидов, которые практически полностью осаждаются 5 объе мами ацетона. Полученный препарат ганглиозидов содержит 397 ф 15 мг Б-ацетилнейраминовой кислоты, определяемой с помощью реэорцинового реактива, и 6124000 1 49500 токсиннейтралиэующих единиц, выявляемых в тесте нейтрализации биологического О действия холерогена в кожной пробе по Крейгу. В надосадочной жидкости, полученной после осаждения препарата ацетоном, ганглиозиды не обнаруживаются. 15П р и м е р 4. В качестве источника получения ганглиозидов используют головной мозг крупногорогатого скота. Конкретное осуществление способа проводят, как описано в при О мере 1. Полученный препарат ганглиоэидов содержит 369 - 18 мг Б-ацетилнейраминовой кислоты, определяемой с помощью резорцинового реактива, и 589700056500 токсиннейтралиэующих единиц, выявляемых в тесте нейтрализации биологического действия холерогена в кожной пробе по методу,Крейга. В надосадочной жидкости, полученной после осаждения препарата ацетоном, ганглиоэиды не обнаруживаются.П р и м е р 5, В качестве источника получения ганглиозидов используют головной мозг барана. Конкретное осуществление способа проводят, как описано в примере 1. Полученный препарат ганглиоэидов содержит 352 й 14 мг Б-ацетилнейраминовой кислоты, определяемой с помощью резорцинового реактива, и 5863000 + 545000 токсиннейтралиэующих единиц, выявляемых в тесте нейтрализации биологического действия холерогена в кожной пробе по методу Крейга. В надосадочной жидкости, полученной после осаждения препарата ацетоном, ганглиозиды не обнаруживаются.Таким образом, получение ганглиозидов предлагаемым способом проходит На 6-7 дней быстрее, чем по известному за счет введенйя осаждения ацетоном. Способ позволяет заменить использование сильнодействующего ядовитого растворителя метанола на этанол, что повышает безопасность получения целевого продукта.