Способ определения тимола в биологических объектах

3 СОВЕТ СКИ П 9) Я РЕСПУБ МЦф чъа ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ЬСТВУ ТОРСНОМУ СВИД-иссриме В Де (71) Краси тельс ветер (53) ного ледова- тальной 1 К ес" кий а мияф 3.ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ 3369739/30-1523.12.811507.83. Бюл. 9 26В.И, Ярошенко, О,А нинЩуляк и С.С. ЯрошеУкраинский ордена оого Знамени научнокий институт экспе нинарин547,56(088,8)1. Мозгов И.Е, фармакологияосф, 1979 с.159.Березкин В,Г. Хроматографичнализ окружающей среды. фХи1979, с. 477-479.Там же, с. 590 (прототип). 11 а о 1 н 33/02 а 01 и 33/12(54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИМОЛЛ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОВЬЕКТАХ, включающий экстрагирование тимола из биологического объекта органическим растворителем, очистку полученного экстракта и хроматографию очищенного экстракта в тонком слое с последующей обработкой хроматографических пластин солью 11 прочный синий Бф и раствором едкого натра, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности способа, после очистки экстракта дополнительно проводят экстракцию тимола гексаиом, хроматографические пластины дополнительно обрабатывают 2-4 н. раствором соляной кислоты, а очистку проводят путем осаждения ти- ЕФ мола уксуснокислым свинцом и/или пу-тем вымораживания экстракта.Изобретение относится к санитариии может быть использовано при санЫ-"тарно-гигиенической оценке продуктовживотноводства после применения тимола в качестве лечебного препарата ( 11 .Известны способы определения Фенолов (тимол представляет собойизопропилметилфенол) на хроматографической пластине с помощью реактиваГиббса (2,б-дибромхинонхлоримида),диазотирующей смеси, состоящей из 10нитроанилина в соляной кислоте инитрита натрия, 4-аминоантипирина,родамина Б, нитробенздиазонийфторбората (соль Прочный синий Б) ( 2 3Наиболее близким к изобретениюпо технической".сущности являетсяспособ определения фенолов в воде,заключающийся в экстракции Феноловиз подкисленой воды хлороформом,отделении хлороформа едким натрием и 2повторном извлечении препарата извновь подкисленной водной фазы эфиром с конечным определением на хроматографической пластине с силикагелем путем обработки.ее диазотирующей смесью (3,),Недостатками этого способа являются низкая чувствительность(10 мг/л) и непригодность для определения Фенолов в биологических объектах, содержащих коэкстрактивные ве-: З 0щества, мешающие выявлению феноловметодом тенкослойной хроматографии. Цель изобретения - повышение точности способа. 35Поставленная цель достигаетсятем, что согласно способу определения тимола в биологических Объектах,включающему экстрагирование тимолаиз биологического объекта органическим растворителем, очистку полученного экстракта и хроматографию очищенного экстракта в тонком слое споследующей обработкой хроматографических пластин солью Прочный синий 45Б и раствором едкого натра, послеочистки экстракта дополнительно прожводят экстракцию тимола гексаном,хроматографические пластины дополнительно обрабатывают 2-4 н.раствором соляной кислоты, а очистку проводят путем осаждения тимола уксуснокислымсвинцом и/или путем вымораживания экстракта,П р и м е р 1. Навеску 10 г мяса, 2,5 г ткани легких измельчаюти экстрагируют мясо 30 мл, а легкие15 мл ацетона на аппарате для встряхивания в течение 60 мин. Ацетоновый экстракт фильтруют через воронку с ватным фильтром в чисзую колбу, 60промывая фильтр 5-10 мл ацетона. Кэкстракту добавляют дистиллированнуюводу в соотношении 1:1,20-ный водный раствор уксуснокислого свинца израсчета 1 мл на 60-70 мл водноацето нового экстракта и помещают в морозилвную камеру бытового холодильника(из мяса 60 мин,ткани легких 120 мин)Затем экстракты центрифугируют 35 мин при частоте вращения 3000 мин,1.Надосадочную жидкость сливают вчистую делительную воронку, Если вэкстракте имеются взвешенные частицы его дополнительно фильтруют черезворонку с ватным фильтром. Послеэтого проводят реэкстракцию тимолав гексан, Для этого к отцентриугированному водно-ацетоновому экстрак"ту в делительную воронку добавляютдистиллированную воду в количестве,равном объему ацетона, взятого дляэкстракции, а также 10 мл гексанаи воронку встряхивают в течение2 мин, Реэкстракцию в гексан проводятдважды (порциями по 10 мл), Гексановые экстракты объединяют, сушат. безводным сернокислым натрием и отгоняютдо объема 0,2-0,3 мл, который наносятна хроматографическую пластину силуфол или со слоем окись, алюминия-гипс.Рядом с пробой на пластине наносятизвестные количества тимола в гексане (стандарты), При необходимостипроводят дополнительную очистку экстракта. Для этого хроматографическуюпластину помещают вначале в камерус гексаном, После прохождения растворителя через всю пластину ее вынимают из камеры, оставляют на воздухе до испарения гексана и затемпомещают в камеру со смесью подвижных растворителей гексан-ацетон всоотношении 24:б. Пластину силуфол последовательно обрабатывают 0,1-ным растворомсоли фПрочный сивий Бф в 70-номэтаноле, 0,1 н, расввором едкогонатра,и 3 н, раствором соляной кисло"ты,После обработки пластины 0,1-нымрастВором соли фПрочный синий Б,а затем 0,1 н, раствором едкого натра остатки тимола проявляются в виде пятен оранжевого цвета, Посленанесения 3 н. раствора соляной кис,лоты цвет пятен изменяется до синегоиногда в пробе до сиреневого.Пластину со слоем окись алюминиягипс обрабатывают 0,1-ным растворомсоли фПрочный синий Б в 70"НОМэтаноле и 3 н, раствором солянойкислотыПосле обработки пластины сольютимол проявляется в виде пятен оранжевого цвета, которые через несколько секунд превращаются в темно-серые,После нанесения 1-2 капель 3 н.раствора соляной кислоты цвет пятен тимола изменяется до синего,Заказ 4968/42 Тираж 873 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП Патентфф, г. Ужгород, ул, Проектная, 4 Общее количество тимола в иссле-;, дуемом объекте определяют по формулеАР5 где Х - общее количество тимола,в мг/кгпвАколичество тимола, обнаруженное в пробе, мкг;Р - масса исследуемой пробы г.Количество тимола в пробе определяют путем сравнения интенсивности.окраски и площади пятна стандарта ипятна исследуемого образца,П р и м е р 2. Навеску 10 г ме-, 5;да растворяют вмл дистиллированСреднее значение 85.1,07.Чувствительность предлагаемого,способа составляет 0,5 мкг тимола внанесенной на пластину пробе или длямяса и меда 0,05 мг/кга для тканилегких 0,20 мг/кг,Предлагаемый способ дает вазйожность осуществлять контроль за чистотой продуктов животного происхожде1 ния после применения тимола с лечебноф профилактической целью, Способ ной воды и экстрагируют 30 мл ацето" на в течение 15 мин на аппарате для встряхивания. Водно-ацетоновый экстракт (верхний слой) отделяют с помощью,делительной воронки, добавляют дистиллированную воду в соотношении 1:1 и помещают в морозильную камеру бытового холодильника на 45-60 мин, Затем экстракт фильтруют через ватный фильтр в делительную воронку добавляют 30 мл дистиллированнбй во. ды и тимол реэкстрагируют гексаном дважды порциями по 10 мл и далее поступают, как в примере 1.В таблице представлены результаты определения количества тимола при добавлении к исследуемим объектам,1требует для проведения анализа небольшое количество реактивов 20- 40 мл ацетона, 20"30 мл гексана, 1 мл 20-ного уксуснокислого свинца на анализ одной пробы).Максимум времени на проведение анализа 3,5-4 ч.Анализу могут быть подвергнуты мясо, ткани легких и мед, что отличает предлагаемый способ от известных и делает его перспективным для широкого использования.