Способ получения нейраминидазы вибрионов

ОП ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик.94(088.8) во делам изобретений и открытийОпубликовано 15,11.82, Бюллетень42 Дата опубликования описания 15.11,82 В. М. Лавровская, 3. Е. Таранюк, Н. М. Юртаева. и Ю. П. Комаров(72) Авторы изобретения Горьковский научно - исследовательский инстит 1 ут эпидемиологии и микробиологии(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НЕЙРАМИНИДАЗЫ ВИБРИОНОВ 1 О 1Изобретение относится к микробиологий и касается производства ферментов,Известен способ получения нейраминидазы вибрионов путем выращивания продуцента в питательной среде в условиях аэрации и пере. мешивания с последующим выделением целевого продукта 11Однако известный способ не обеспечивает высокой активности целевого продукта (активность 50 ед/мл). Целью изобретения является повышение активности целевого продукта.Цель достигается тем, что согласно способу получения нейраминидазы: вибрионов путем выращивания продуцента в питательной среде в условиях аэрации и перемешивания с по.следующим выделением целевого продукта, в качестве продуцента используют штамм нехолерного водного НАГ - вибриона 59041, выращиО ванне ведут при 27 - 29 С, скорости аэрации 2 - 1 и/л среды и перемешивания 500 - 200 об/мин в течение 6 - 8 ч, затем добавляют раствор СаС 1 т до конечной концентрации 0,4 - 0,6% и 20 %-ный раствор уксусной кислоты до установления рН 5,5 - 6,0.При этом 20%-ный раствор уксусной кислоты вводят одновременно с раствором СаС 1 или через 1 - 2 ч после добавления этого раствора.Способ осуществляют следующим образом.Ферментсодержащую культуральную среду получают путем культивирования продуцента нейраминидазы на бульоне из ферментативного гидролизата казеина в реакторе при непрерывной подаче воздуха и перемешивании без дополнительного введения углеводного питания.Основные параметры: температура (27 - 29), рН среды (6,9 - 7,0), степень аэрации (воздух от 2,0 до 1 л/л среды, перемешивание от 500 до 200 об/мин) регистрируют с помощью электронного пульта управления. Время выращивания 8 ч, после чего производят активацию фермента в два этапа, путем добавления хло з ристого кальция до конечной концентрации 0,5% и подкисления культуральной взвеси уксусной кислотой до рН 5,5 - 6,0 через 1 - 2 ч. При этом 1 в качестве продуцента нейраминипазы исполь973613 ВНИИПИ Заказ 8617/29 Тираж 505 Г 1 одписное Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная,4 3зуют штамм нехолерного водного НАГ виб. ,риона 59041,Выделение иэ культуральной среды очищенного фермента проводят методом ионообменной хроматографии.П р и м е р 1, В 35-литровый реактор загружают 20 л бульона из казеинового гидролизата с содержанием НН,= 180 мг %, пептона 0,5%, рН 6,8 - 7,0. Плотность посевного материала - смыв 18-часовой агаровой культурыштамма нехолерного водного НАГ-вибриона 59041 составляет 100 млн микробных клеток /мл среды. Выращивание в течение 8 ч ведут при +28 С в условиях регулируемой аэрации воздухом (от 2,0 до 1 л/л среды) и перемешивания (от 500 до 200 об/мин). Активность полученного ферментсодержащего фильтрата 2 тыс. РДЕ, что в 2 - 4 раза превышает активность культуральной среды, полученной при культивировании того же штамма в колбах на качалке (512 - 1 тыс. РДЕ). При активации фермента ионами кальция, проведенной добавле кием раствора СаС 1 до конечной концентрации . 0,5% с одновременным подкислением культу. ральной взвеси 20% уксусной кислотой до рН 5,5 - 6,0, получено повышение активности еще в 2 раза - . до 4 тыс, РДЕ. Режим активащи вдва этапа путем добавления СаС 1 и последующим подкислением до рН 5,5 - 6,0 через 1 - 2 ч позволяет повысить активность до 8 - 16 тыс. РДЕ.Двухэтапная активация фермента в культу- ральной жидкости, выращенной в колбах на качалке, равняется в 2 тыс. РДЕ, Таким образом, активность ферментсодержащего фильтрата культуры нехолерного водного НА 1 - вибриона 59041, полученного за 8 ч культиви . рования в реакторе предлагаемым способом превышает активность, получаемую в колбах на качалке за 18 - 20 ч в 4 - 8 раз.П р и м е р 2. В 35-литровый реактор загружают 20 л бульона из казеинового гидролизата с содержанием ИН, 180 мг %, пептона 0,5%, рН 6,8 - 7,0 Плотность посевного материала - смыв 18 ч агаровой культуры штаммахолерного вибриона У 1409 - составляет 100 млн. микробных клеток/мл. среды. Выращивание в течение 8 ч ведут при +28 С в условиях регулируемой аэрации воздухом (от 2,0 до 1,0 л/г среды и перемешивания (от 500 до 200 об/мин)Нейраминидазная активность полученного ферментсодержащего фильтрата 1,5 тыс. ВОЕ и 100 ед/мл при определении тиобарбитуровым методом по Уоррену) . 411 ри активации фермента ионами кальция,проведенной добавлением раствора СаС 1, доконечной концентрации 0,4 - 0,6%, с одновременным подкислением культурной взвеси 20%уксусной кислоты до рН 5,5 - 6,0 полученоповышение активности до 2 тыс, ВОЕ и130 ед/мл при определении тиобарбитуровымметодом по Уоррену,При двухэтапной активации (добавление0 СаС 1 и последующее подкисление до РН 5,5 -6,0 через 1 - 2 ч) активность ферментсодержа 1 щего фильтрата 4 тыс. ВОЕ и 140 ед/мл приопределении тиобарбитуровым методом поУоррену. Таким образом, активность фермент.15 содержащего фильтрата культуры холерноговибриона У 1409, полученного за 8 ч культивирования в реакторе предлагаемым способом,превышает активность, полученную в колбах накачалках за 18 - 20 ч в 4 раза по титрам ВОЕ20 и в 1,7 раза при определении тиобарбитуровымметодом по Уоррену.Предложенный способ позволяет повыситьактивность целевого продукта в 8 - 16 раз присокращении времени получения с 18-20 до258 ч Формула изобретения З 0 1. Способ получения нейраминидазы вибрионов путем выращивания продуцента в питатель.ной среде в условиях аэрации и перемешивания с последующим выделением целевого продукта, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью повышения активности целевого продук, та, в качестве продуцента используют штаммнехолерного водного НАГ-вибриона 59041,выращивание ведут при 27 - 29 С, скоростиаэрации 2 - 1 л/л среды и перемешивания 500 - 40 200 об/мин в течение 6-8 ч, затем добавляютраствор СаС 1 до конечной концентрации0,4-0,6% и 20%.ный раствор уксусной кислотыдо установления рН 5,5 - 6,0.2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что 20%-ный раствор уксусной кислоты вводят одновременно с раствором СаС 1,или через 1 - 2 ч после добавления этогораствора,Источники информации,принятые во внимание при экспертизе 501, Вертиев Ю. В. и др. Выделение и характеристика нейраминидазы продуцируемой неагглютинизирующимися вибрионами. - "Биоорганическая химия", 1975, 1, 11, с, 1639,