826241

Союз Советских Социалистически кРеспублик(22) Заявлено 260379 (21) 2742062/28-13с присоединением заявки М 9 О 01 Б 33/52 Государственный комитет СССР по дедам изобретениИ и открытийДата опубликования описания 300481 3А.Б. Самаль, С,Н, Черенкевичи А.М. КгоЖоХ4. ч с;г а1:а 1 йз 1 т 1;лБелорусский ордена Трудового Красного Знаменигосударственный университет им, В.И. Ленина(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СЕРОТОНИНА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ10 20 25 30 Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано как физико-химический метод исследования серотонина и определения его концентраций в биологических средах, крови, плазме, суспензиях тромбоцитов и т.д.Известен способ определения серотонина в биологических жидксстях путем измерения интенсивности их Флюоресценции до и после обработки биологической жидкости ,перекисью водорода 1 1.Однако определить серотонин известным способом сложно, требуется Много времени и происходят большие потери серотонина при экстрагирова-нии (до 50). Цель изобретения - повышение точности способа." Эта цель достигается тем, что способ определения серотонина в биологических жидкостях осуществляют путем измерения интенсивности их Флюоресценции до и после обработки биологической жидкости перекисью водорода, при этом-биологическую жидкость обрабатывают перекисью водород. при концентрации последней 0,0003-0,003 в присутствии пероксидазы,Для определения серотонина, определяют уровень интенсивности ультрафиолетовой Флюоресценции раствора,содержащего серотонин, затем добавляют пероксидазу и НО .(в концентрации 0,003-0,0003). Завершение реакции сопровождается полным исчезновением ультрафиолетовой Флюоресценции серотонина.Таким образом, по исчезновениюультрафиолетовой Флюоресценции серотонина, исходная интенсивность ко"торой пропорциональна исходной концентрации серотонина, определяютего концентрацию. Исследование люминесценции проводят на обычнйхфлюориметрических установках, работающих в режиме измерения среднего тока или счета фотонов. В результате исследований спектров поглощения люминесценции серо- тонина и перекиси водорода установлено, что поглощение используемых концентраций Н О(0,003-0,0003) незначительно,и экранирующего эффекта ИО на флюоресценцию серотонина нет.,Тромбоциты Тромбоциты Тромбоциты Тромбоциты 1100 2,2 ф 10 М 7,6 Тромбин 10 М 1500 310 М Серотонин10 М 6,5 1400 2,8 10 М Стандартсеротонина 6,5 и7,6,10 М 10 М 500 П р .и м е ч а н и е . Изменение, интенсивности флюоресценциитромбоцитов при добавлении к ним пероксидазы и Н 2 О (А 296 нм, Аф330 нм) .Формула изобретения55биологическую жидкость обрабатываютперекисью водорода при концентрацииСпособ определения серотонина в 0,0003-0,003 в присутствий .пероксибиологических жидкостях путем из" ,доз амерения интенсивности их флюорес- Источники информации, ценции до и после обработки биологи- принятые во внимание при экспертизе ческой жидкости перекисью водорода бО 1. Патохимия и клиническая биохио т л и ч а ю щ и й с я тем, что, мкя. Сборник научных трудов. Иркутск,целью повышения точности способа, " 1973, 121, с. 84-85.ВНИИПИ Заказ 2368/33 Тираж 907 ПодписноеФилиал ППП Патент", г.ужгород, ул.Проектная,4 В присутствии 0,01 мг/мл перокси дезы и 0,003-0,0003,перекиси водорода происходит полное окисление серотонина в широком диапазоне концентраций 10 4- 10 фМ, Время определения серотонина в жидкости в этом случае 5"10 мин.Варьированиемювг концентраций пероксидазы ( О, 2- О, 0 01 в ) и НйО ( О, 0 0 3- О, 0 0 0 3) вРемя определения серотонина можно сократить до 2- 5 мин.Во всех случаях соблюдается линейная зависимость Ы=(1 Н -1) после окончания реакции от концентрации серотонина.С целью проверки специфичности этой реакции исследован целый ряд триптаминов, ароматических аминокислот и белков плазмы.Добавление пероксидазы и Н 20 не приводит к изменениям интенсивности флюоресценции этих веществ, поэтому наличие их в биосистемах не оказывает влияния на. определение концентрации серотонина.П р и м е р , Определение концентрации свободного серотонина в реакции высвобождения из тромбоцитов под действием агрегирующих агентовДля этого из тромбоцитов (число клеток 108 мл) при инкубировании последних в среде с агрегирующими агентами (РН 7,6 тромбин) к надосадочной жидкости (1,8 мл), получаемой после центрифугирования взвеси сти-, мулированных тромбоцитов, добавляют 0,1 мл 0,05 пероксидазы и 0,1 мл0,003-ного Н О, Фиксируют изменение флюоресценции и полученный резЖльтат сопоставляют с калибровочнойкривой.Для построения калибровочнойкривой используют серотонин в тойже среде, что и тромбоциты, Линейнаязависимость интенсивности флюоресценции серотонина на длине волны 330 нмот концентрации серотонина сохраняется до концентрации 10 ОМ.В таблицепредставлены данные определения серотонина по предлагаемому способу в отмытых.тромбоцитах.Из данных приведенных в таблице,видно, что при стимулировании тром боцитов тромбином или изменении РН,происходит выделение серотонина, концентрация которого легко определяется предлагаемым способом, При добавлении серотонина к тромбоцитам, нао ходящимся в среде с РН 7,б, т.ек стимулированным тромбоцитам, поглощения серотонина нэ происходит иобщая концентрация определенногосеротонина состоитиз серотонина,вышедшего из тромбоцитов при их сти мулировании изменением РН среды, исеротонина, добавленного в раствор(оПредлагаемый способ определениясеротонина обладает высокой чувст- ЭО вительностью, не требует применениядополнительных методов обработкибиологических жидкостей, являетсяспецифическим и экспресс-методом.