Способ количественного определения №-ацетилсульфаниламида и сульфаниламидав смеси

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВтОРСКОМ свкдетЕЛЬСтвуСоюз Советских Социалистических Республик(, 30 с присоедпнсниех вки а МПК 1 п иоритет Комитет по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССРХ 1,1968. Бюллетень ЛЪця описация 6.Ч,969,42.062 (088.8 ДК Опубликовано 28 Дата опубликова Авторы:зобретени В. С. Родионов и Е, И. Лизенко ститут биологии Петрозаво имени Овитель СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ 4 АЦЕТИЛСУЛЬФАНИЛАМИДА И СУЛЬФАНИЛАМИ В СМЕСИ(7, 255 - 7 гилк); е, - молярный коэффициент поглощения, равный 15 400 (7, 252 - 8 .ила); Е, - суммарцая оптическая плотность данного раствора при подкислеции до рН 3,5;5 Е, - оптическая плотцость 4-ацетилсульфаниламида; Е - суммарная оптическая плотность данного раствора прц рН 4 - 13; Ка ц К, - отношение оптических плотностси, измеренных при рН 4 - 13, в максимуме погло 10 щения к оптическим плотностям, измереннымпри рН .-. 3,5 1 Е 257 - 2 бз)Через Ки К, учитывают поправки науменьшение молярных коэффициентов поглощения с падением рН среды и поправки ца15 измерение оптических плотностей при рН 3,5)це в максимуме поглощения.ЛОлярный коэффициент поглощения Л 4- ацетилсульфаниламида не изменяется в пределах рН О,1 - 13 и уменьшается ниже и выше20 этих пределов. Молярный же коэффициентпоглощения сульфанил а мида падает при рН(4,0, а при рН(0,5 он изменяется незначительно.кон 11 а основании такого различия свойств Л 7425 ацетилсульфаниламида и сульфаицламцда взависимости от кислотности среды можно вычислить математически концентрацию каждого компонента в смеси без их разделения.Оптическую плотность Е желательно измеЗ 0 рять при 257 ллк в пределах рН 4 - 10, так Е л; С, = Ка - Е Ка (Еа).а нтрации Л(4 - ацетилсу льфанил амида, соответстслоя жидкости в кювет эффициент поглощения,па мида и с( - толщимолярцый й 19 000 чьфанивенно;с; варави Способ количественного спектрофотометричсского определения Х 4-ацетилсульфанилам ида и сульфаниламида в смеси относится к области биохимии. Он может быть использован для изучения ацетилировация сульфаниламида в изолированных хлоропластах листьев растений, Принцип метода может найти применение при ферментативном анализе ацетата, ацетил-КоА, а также количественном определении ферментов-ацетил-Ко А-синтотазы и ариламин-ацетилтрансферазы.Предлагаемый способ основан на измерении оптических плотностей Х 4 ацетилсульфаниламида и сульфаниламида в средах с различными рН.По приведенному уравнению концентрации компонентов смеси определяют по значениям оптических плотностей, полученных при одной и той же длине волны в растворах с рН 0,1 - 0,5 и 4 - 10: го государственного университета Куусинена231885 Предмет изобретения 40 45 50 Составитель А, ТищенкоРедактор Г. Гуськова Текред Л, К. Малова Корректор Т. Д. Чунаева Заказ 343/13 Тираж 530 Подписное 13 НИИПИ Комитета по делана изобретений и открытии при Совете Мцнистров СССР Москва, Центр, пр. Серова, д. 4Сапунова, 2 Типография,пр. как в этих условиях не требуется введение специального поправочного коэффициента на измерение оптической плотности не в максимуме поглощения сульфаниламида, При измерении же величин Е в пределах рН 10 - 13 поправочный коэффициент следует учитывать.Чтобы определить концентрацию сульфаниламида и Ла-ацетилсульфаниламида в смеси по одному измерению в сильнокислой среде в конкретных условиях опыта, строят калибровочный график. Для этого в пробирки вносят по 0,1 мл смеси указанных сульфамидов разной концентрации. Затем добавляют 3,9 м,1 буферного раствора Мв 1. Смесь перемешивают, и измеряют оптическую плотность растворов.Очистка биологической жидкости.Метод использован для изучения процесса ацетплирования сульфаниламида в хлоропластах, Прямому спектрофотометрическому определению этих сульфаниламидов в суспензии хлоропластов, содержащей необходимые компоненты для ацетилирования сульфаниламиды мешают АТФ, АМФ, КоА, белки и другие вещества, имеющие поглощение в УФ-свете. Частичную очистку системы проводят на алюминиевом геле (гидроокиси алюминия), который получают добавлением в инкубационную смесь А 1 в(ЯО)а и КОЕЕ. Белок осаждают добавлением 5% НСОа В ходе опытов устанавливают, что осаждение мешающих веществ па алюминиевом геле в значительной степени зависит от рН раствора, При р 1-1 5 - 6 наблюдают практически полное осаждение АТФ, АМФ, КоА. При этом К-ацетилсульфаниламид и сульфаниламид обнаруживают в надосадной жидкости,Ход анализа.Инкубационная смесь для изучения ацстилирования сульфаниламида в хлоропластах содержит, люклоль: 150 трис-НС 1-буфер прп рН 8,5; 1050 сахарозы; 4 АТФ; 3,0 ацетата калия; 10 МрС 1 а, 0,4 КоА; 1,86 сульфанпламида, а также суспензию хлоропластов (0,4 - 0,6 лг хлорофила), Общий объем инкубационной смеси 4 м.г.К 4 л,г инкубационной смеси в колбе Зрленмейра приливают 2 мл 5/,-ной 1-1 С 10 и содержимое перемешивают вращательным движением колбы. В колбу вносят 1,0 лт,г 1 МА 1 в(ЯО) в и 5 Н КОН. Предваритепьно определяют количество вносимой щелочи пу 5 10 15 20 25 30 35 тем титрования специальной пробы, в которую добавляют все указанные выше компоненты смеси, раствором 5 Н КОН до рН 55. При титровании щелочь приливают к пробе из 1-.ял микробюретки.Количество вносимой щелочи колеблется в пределах 1,2 - 1,8 м,г. После добавления в исследуемые пробы найденного количества 5 Н КОН смесь перемешивают, и полученную суспензию центрифугируют 20 л 1 ин при 15000 д. К 3 лл надосадочной жидкости добавляют 3 мл 20/о-ной НС 10 аПри этом рН раствора меньше 0,5, Оптическую плотность проб измеряют при длине волны 257 ллк, Количество Х 4-ацетилсульфаниламида определяют по калибровочному графику.Для построения калибровочного графика к 3,8 лл инкубационной смеси добавляют 2 я,г 5 с/о-ной 1-1 С 104, 0,2 м,г смеси указанных сульфамидов разной концентрации; 1,0 л,г А 1 а(50 в)а и 5 Н. КОЕ 1 (р 1-1 4,5). Смесь перемешивают, очищают па алюминиевом геле, спектрофотометрируют, как описано выше. На оси абсцисс откладывают концентрации Х- ацетилсульфаниламида и сульфаниламида, а на оси ординат - их оптические плотности.При проведении определения в условиях, имитирующих ацетилирование сульфанпламида, начальная концентрация которого известна, концентрацию Ха-ацетилсульфаниламида и сульфаниламида вычисляют по одному измерению оптической плотности при длине волны 257 лю,як при р 1-1 0,1 - 0,5. 1, Способ количественного определения Х"-ацетплсульфаниламида и сульфаниламнда в смеси, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения, анализируемую смесь обрабатывают хлорной кислотой и смесью сернокислого алюминия и едкого калия, центрифугируют, подкисляют и спектрофотометрируют дважды при одной длине волны в интервале 255 - 263 ялик при различных рН среды (от - 1,8 до +3,5 и 4 - 13) и расчетным путем определяют содержание компонентов в смеси.2. Способ по и. 1, от,гичиющийся тем, что спектрофотометрируют при 257 млк и рН 0,1 - 0,5 и 4,0 - 10.