Раствор для консервирования костного мозга млекопитающих при низкой температуре

РАСТВОР ДЛЯ КОНСЕРВИРОВАНИЯ КОСТНОГО МОЗГА МЛЕКОПИТАЮЩИХ ПРИ НИЗКОЙ ТЕМПЕРАТУРЕ, содержащий этилендиаминтетраустат натрий, антикоагулянт и бидистиллированную воду, отличающийся тем, что, с целью повышения жизнеспособности за счет сохранения стволовых кроветворных клеток, он дополнительно содержит гексаметиленбистетраоксиэтилмочевину и 1,2 - пропандиол, в качестве антикоагулянта лимонную кислоту при следующем соотношении компонентов:
Гексаметиленбистетраоксиэтилмочевина 20,0 40,0
1,2 Пропандиол 1,0 2,0
Этилендиаминтетраацетат натрия 0,05 0,15
Лимонная кислота 0,5 -1,5
Бидистиллированная вода Остальное.

Изобретение относится к медицине, а именно к консервированию миелокариоцитов.
Известны растворы, предложенные для низкотемпературного (-78 -90^оС) консервирования костного мозга и содержащие криопротекторы низкомолекулярный поливинилпирролидон (ПВП), глицерин или диметилсульфоксид (ДМСО) (Пушкарь Н. С. Белоус А.М. Куцаева А.А. Шенберг М.Г. Лобынцева Г.С. Луговой В.И. Актуальные проблемы криоконсервирования костного мозга. Респ. межвед.сборник АН УССР "Криобиология и криомедицина", вып. 2, 1976, с.3-16; Лаврик С.С. "Консервирование костного мозга". Киев. Здоровье, 1975; Лаврик С.С. Афанасьева Е.Ю. Когут Г.И. Среда для консервирования лейкоцитов при низких температурах. А.с. N 254016, от 07.10.69).
На основании сведений, содержащихся в указанных публикациях, эти растворы при замораживании костного мозга обладают достаточно высоким хладоограждающим действием на костно-мозговые клетки (позволяют сохранить репродуктивную колониеобразующую способность стволовых клеток в среднем 37 (от 20-25 до 40-63%). В то же время применение глицерина и ДМСО в оптимальных для замораживания кроветворных клеток концентрациях (соответственно 15 и 10%) ввиду их токсичности для миелокариоцитов и макроорганизма требует отмывания криопротектора от костного мозга перед трансплантацией, что ведет к дополнительной потере гемопоэтических клеток и понижению их жизнеспособности. ПВП обладает не только менее выраженным защитным эффектом, чем глицерин и ДМСО, но и вызывает латентные повреждения значительного количества (до 20%) клеток в размороженной костно-мозговой взвеси.
Известен раствор для низкотемпературного консервирования костного мозга, содержащий этилендиаминтетраацетат натрия, натрий лимоннокислый трехзамещенный цитрат, глицерин, гемодез (Шишкина И.Д. Применение комбинированного криофилактического раствора для замораживания клеток костного мозга. Пробл. гем. и перел. крови, 1975). Однако этот раствор обеспечивает сохранение жизнеспособности менее 50% стволовых клеток костного мозга.
Цель изобретения повышение жизнеспособности за счет сохранения стволовых кроветворных клеток при замораживании до -80^о -90^оС.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
П р и м е р 1. Раствор готовят следующим образом. Взвешивают требуемые навески гексаметиленбистетраоксиэтил- мочевины, 1,2-пропандиола, этилендиаминтетраацетата натрия; лимонной кислоты и растворяют их в бидистиллированной воде, подогретой до +60^оС. Полученные растворы сливают и доводят до окончательного объема бидистиллированной водой.
Приготовленный раствор фильтруют и разливают по 100 мл в стандартные бутылки вместимостью 250 мл по ГОСТ 10782-77. Бутылки укупоривают пробкой из резиновой смеси марки 25-П по ТУ 38-006269-80 и завальцовывают алюминиевыми колпачками по ОСТ 64-7-85-79. Затем бутылки завязывают в двойные бязевые мешки. Стерилизуют в автоклаве при 1,2 атм (122,7^оС) в течение 30 мин. После стерилизации раствор хранят при -2-4^оС в двойных бязевых мешках в течение 6 мес. (срок наблюдения) или при комнатной температуре (15-20)^оС в течение 2 мес. (срок наблюдения).
Готовый раствор прозрачен, желтоватого цвета, без запаха, рН 7,0-7,38. Он хорошо смешивается с взвесью костно-мозговых клеток, предотвращает их конгломерацию, обеспечивает морфологическую сохранность ядросодержащих клеток при положительной температуре.
Раствор обладает выраженным хладозащитным действием при замораживании костного мозга до -90^оС по трехэтапной программе: 1) охлаждение со скоростью 1^о/мин до 7^оС, 2) 10^o/мин до -40^оС, 3) 20^о/мин до -90^оС. Размораживают костно-мозговую взвесь в водяной ванне при температуре +39^оС в течение 1 мин (до температуры биопродукта в контейнере +2^оС). После оттаивания сохраняется достаточно высокий процент стволовых кроветворных клеток от 55,7-69,2 до 86,3% в среднем 80% Эти данные получены в исследованиях, проведенных в лаборатории консервирования крови и тканей Кировского НИИ гематологии и переливания крови на 400 мышах инбредной линии (СВА х С57В16) F₁ с клонированием стволовых гемопоэтических клеток в селезенках смертельно облученных животных (доза облучения 900 рад).
Результаты консервирования костного мозга с различными вариантами предложенного ограждающего раствора представлены в таблице.
Раствор для низкотемпературного (-80 -90^оС) консервирования костного мозга, предназначенного для клинического применения, позволяет сохранить после замораживания-оттаивания в среднем 92% эозинорезистентных и 80% стволовых кроветворных клеток. Раствор нетоксичен, не требует отмывания криофилактиков из размороженной костно-мозговой взвеси, апирогенен. Средняя летальная доза (ЛД₅₀) его для мышей составляет 15,5 г/кг массы животного.
Предлагаемый раствор не вызывает латентные повреждения костно-мозговых клеток, а также обеспечивает больший процент, чем прототип, сохраненных стволовых гемопоэтических клеток и не требует отмывания криопротекторов после размораживания биообъекта.
Указанные свойства предложенного ограждающего раствора создают удобства и делают раствор эффективным в практической работе по созданию банков замороженного костного мозга для клинических целей.
Изобретение относится к медицине, в частности к консервированию и трансплантации миелокарноцитов. Целью изобретения является повышение жизнеспособности костного мозга. Компоненты содержатся в растворе в следующих количествах, мас. % : гексаметиленбистетраоксиэтилмочевина 20,0 - 40,0; 1,2-пропандиол 1,0 - 2,0; этилендиаминтетраацетат натрия 0,05 - 0,15; лимонная кислота 0,5 - 1,5; бидистиллированная вода - остальное. Раствор представляет собой прозрачную, без запаха жидкость желтоватого цвета, имеющую рН 7,0 - 7,38, легко смешивается с нативным и стабилизированным костным мозгом, предотвращает конгломерацию костно-мозговых клеток. 1 табл.