Способ определения повреждения микроорганизмов

ОЮЗ СОВЕТСНИХО ЛИСТИЧЕСНИХ ПУБЛИН.,ЯОдщй 2 я,1 02 С 12 й 13 3 Г 51) С ОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬГГ 3480628/28-1305.08.8207.06.84, Бюл. Р 21В,М,фомченков, В.А.Чугужермачев и П.В,БабаеваВсесоюзный научно-исслеинститут прикладной мик.К7 ватель биолоский гии (53) (56) Эксп ейнелл обиоло ия,и др, П днородн поле -В ведение м перекн.: зика 68. где о лет енн пра опу нных клев в иссле. и биофи1969,тельство1/34, 19 роорга ССС3,9 46 раз- Яук а(54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕН ДЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ при воздейстниях по степени э тации клеток при помещени суспензии н переменное эл поле, о т л и ч а ю щ и й что, с целью повышения то лиза, определяют степень ентации образцов интактны ностью поврежденных микро и исследуемого образца по опт ческой плотности клет причем о ции клето удельной зии микро и напряж (2-15) 10 и -576.8,095(088,8) 1, Мейнелл Дж ериментальная мик"Мир", 1967, 12,Дегтярена Т.В. ок хлореллы в нео ом электрическом вляемый биосинтез ляций. Красноярск Авторское свиде 9748, кл. С 12 МИЯ ПОВРЕЖ- внешних лектроориен. и клеточной ектрическое с я тем, чности ана- электроорих и полорганизмовизменению очной суспензии при частоте электрполя соответственно(5 10(1 10 -1"10 ) Гц, нычислыотстепеней электроорнентациидого образца на этих частоповреждение микроорганизмодуемом образце оценивают пошению поврежденных и неповрмикроорганизмов согласно йо ческого10) и отношение для кажах, а в иссле - соотно - ежденных рмуле процент неповреждеток микроорганизмодуемом образце,отношение степени электориентации клеток микронизмов н исследуемом обце н электрическом пслезанных частот,то же, для клеток интактныхмикроорганизмов;то же,для клеток полностьюповрежденных микроорганизмов,пределенне степени ориентак ведут при рН 4,5-7,5,электропроводности суспеорганизмов (10 - 10 ,Ом.оставитель О.Скородумов ехред С,Легенда Корректор я Редактор Т,Портная Тираж 522ПИ государственного комитета СССо делам изобретений и открытийМосква, Ж, Раушская наб., д аказ 374 дисно 1130 П "Патент", г. Ужгород, ул, Проектная,или алИзобретение относится к микробиологии и может быть использованов исследовательской работе и микробиологической промышленности дляопределения действия на микроорганизмы.повреждающих Факторов.Известен способ определения микроорганизмов, способных к размножению,после воздействия на них повреждающих Факторов путем их посева на питательный агар и подсчета выросшихколоний 1 .Недостатками известного способаявляются большая длительность от1 до 14 сут), связанная с тем, чтоскорость роста микроорганизмов на л 5агаре невелика и для образованиязаметной колонии требуется значительное время. Кроме того, этот способимеет недостаточную точность (погрешность измеоений до 30 , что обус ловлено неустранимыми погрешностямипри разведении исходного препаратаи распределении посевного материалана питательном агаре.Наиболее близким по, технической 25сущности к предложенному являетсяспособ определения повреждения клеток хлореллы при воздействии на нихповреждающих Факторов по степениэлектроориентации при помещении суспензии клеток в переменное электрическое поле.Согласно этому способу клеткипомещают в переменное электрическоеполе и наблюдают с помощью микроскопа за их поведением в поле, Повреждение микроорганизмов определяют постепени электроориентации, т,е. попотере ими способности образовьватьцепочки вдоль силовых линий поля ипо смещению частотных границ, на которых наблюдается вращение клетоквблизи электродов 2) .Наиболее существенными недостатками этого способа являются отсутствие количественной оценки процента поврежденных микроорганизмовв анализируемом образце и наличиесубъективной ошибки вследствиевизуального определения повреждения клеток, 5 фуЦель изобретения - повышение точности анализа, т.е, определение поврежденных микроорганизмов в анализируемом образце,Указанная цель достигается способом определения повреждения микроорганизмов при внешних воздействиях по степени электроориентации клеток при помещении клеточной суспензии в переменное электрическое поле, при чем определяют степень электроориентации образцов интактных и полностью поврежденных микроорганизмов и исследуемого образца по изменениюоптической плотности клеточной су спензии прл частоте электрического поля ( 5 10 -5 10 ) и 110 -1 10 ) Гц, вычисляют отношение степеней электро- ориентации для каждого образца на этих частотах, а повреждение микроорганизмов в исследуемом образце оценивают по соотношению поврежденных и неповрежденных микроорганизмов согласно формуле- 100 /0о Р 1где ж - процент неповрежденныхклеток микроорганизмовв исследуемом образце;(3 - отношение степени электроориентации клеток микроорганизмов в исследуемом образце в электрическом поле указанных частот;то же, для клеток интактныхмикроорганизмовто же,для клеток полностьюповрежденных микроорганизмов,причем определение степени ориентации клеток ведут при р 4,5-7,5,удельной электропроводности суспензии микроорганизмов 10 -10 ) Ом ми напряженности электрического поля2-15) 10 В/м,а Фиг,1 дана частотная зависимость степени электроориентации клеток Раеийощопаа аегпд 1 пояа, инкубированных при разных температурах втечение 15 мин; 1-25, 2-44, 3-61 С,6810 Ом гл; на фиг,2 - то же,-4клеток Еаспег 1 спса со 21, инкубированных при различных температурах втечение 15 мин: 1-37, 2-49, 3-55 С,6=10 Оми ", р 4,5; на фиг.3 - тоже, р 7,5, на фиг,4 - то же, приразной злектропроводности суспензии,Ол м : 1-10 ", 2-3 10 4, 4-10 , 517 10 , р 6,5; на фиг,5 - зависимость степени электроориентации отнапряжения на эдектродах ячейки длябактериальных клеток Вас 111 иа 1 Ьиг 1 п 6:епа 1 е (1) и Рвеийощопаа аегпяпоза (2) при частоте электрическогополя 105 Гцэлектропроводности суспензии 10Ом 1 м 1 и р 5 5 на иг,6схема устройства, реализующегопредлагаемый способ; на фиг.7 - час.тотная зависимость степени электроориентации клеток Ееспег 1 сп 1 а со 2,инкубированных при различных температурах в течение 15 мин;1-37, 2-47,353, 4-61 С, р 6, б =10 Ои м ;,на фиг.8 - то же клеток Езспег 1 сп 1 асо.1 интактных (1) и подвергнутыходнократному 2) и четырехкратному(время обработки 20 мин), рН 6,5,6=210 Ом м .Согласно представленным графикамдостаточно достоверное определениестепени электюоориентации клетоквозможно при указанных параметрах 1 Оэлектрического поля, так как именнов этих условиях имеют место характерные изменения кривых частотной зависимости степени электроориентации,что и позволяет использовать отношение эффектов, регистрируемых в полемегагерцевой и килогерцевой частот,для количественной оценки числа поврежденных клеток (по расчетной Формуле) . При укаэанных напряженности 2 Оэлектрического поля,рН и удельнойэлектропроводности суспензионнойсреды это отношение имеет максимальную величину для интактных клеток,что также повышает точность измерений,Измерения проводят при напряжениина измерительной ячейке, соответствующем линейному участку ее амплитудной характеристики, 30Определение килогерцевого и мегагерцевого диапазона частот,Килогерцевый диапазон частотвключает частоты от 4 10 до 4 10 Гц,а мегагерцевый от 10 до 10 Гц.Указанные пределы определяются тем,что у клеток разных видов областьминимума (в килогерцевом диапазонеи максимума(в мегагерцевом диапазоне) частотной зависимости степениэлектроориентации несколько отлича Оется (фиг. 1 и 2), а также тем,что в области максимума и минимумадопустима регистрация эффекта начастотах, где имеет место 10-оеизменение эффекта по отношению к 45экстремальной величине,Диапазон рН исследуемой суспензии определен в пределах 4,5-7,5, таккак в этом случае обеспечиваются наилучшие условия регистрации повреждения клеток, особенно при низких рН (Фиг.2 и 3), а также потому, что в этом диапазоне бактериальные клетки наименее подвержены слипанию, ухудшающему наблюдение эффекта электроориентации, Соответствующими измерениями установлено, что в случае ЕесЬегсЬ 1 а соР 1 наблюдают слипание клеток при рН с 4,0 и рН7,5.Диапазон удельной электропровод ности исследуемой суспензии определен в пределах от 10 до 10 Ом м , ,так как при этих значениях обеспечивается наиболее надежная регистрация килогерцевого минимума и мега- А 5,герцевого максимума частотйой зависимости степени электроориентации(Фиг.4), Увеличение электропроводности свыше 10 Ом м нежелательнов связи с ростом мешающих факторов(разогревание суспензии, тепловаяконвекция), снижающих точность измерения степени электроориентации,Диапазон напряженности электрического поля определен в пределахот 2 103 (О =6 В) до 1510 В/м (О =45 В , так как он соответствуетмаксимальному изменению эффектаэлектроориентации в зависимости отнапряжения на электродах ячейкифиг.5), а именно эта область значений напряжений позволяет наиболееточно выявить и зарегистрироватькилогерцевый минимум и мегагерцевыймаксимум частотной зависимости степени электроориентации клеток, чтов конечном счете обеспечивает достаточно высокую точность при определении повреждения кле ок согласноизобретению,Из фиг,5 видно, что область допустимых значений напряжения (заштрихованная) для более крупных клеток (кривая 1) лежит при меньших,а в случае более мелких клеток(кривая 2) пои больших значениях на.пряжения на электродах ячейки.( и,следовательно, напряженности поляв суспензии),П р и м е р 1, Исследуют тепловое повреждение грамотрицательныхбактерий ЕесЬег 1 сЬ 1 а соР 1 НВ,0,Клетки инкубируют при температуреот 37 до 61 С в течение 15 мин,Измерения электроориентации по предлагаемому способу можно проводитьв средах с удельной электропроводностью от 10 1 Ом м и ниже и прирН 4-12. Однако опыты показали, чтоповреждения клеток выявляются лучше, если параметры суспензии выбирают следующими; удельная электропроводность 10Ом м и ниже, рН 7,5и ниже, Поэтому параметры суспензииследующие; удельная электропроводность 210Ом "м , рН 6,0.Степень электроориентаиии микроорганизмов определяют на известномустройстве для контроля йизиологичес.кого состояния клеток (3 .На фиг,6 изображена блок-схемаустройства, которое состоит из источника 1 света, измерительной ячейки 2 с решетчатыми электродами 3и 4 и окнами 5 из оптического стекла,фотоэлемента 6, самопишущего потенциометра 7, генератора 8 переменногонапряжения и вольтметра 9,Устройство работает следующим образом.Световой поток от источника 1, пройдя диэлектрофоретическую ячейку, 0,93 25+ 3 4+1 1,01 61 0,90 61 1,00 0 2, фотоэлементом 6 преобразуется вэлектрический сигнал, регистрируемый самописцем 7. Неоднородное электрическое поле создается в заполняющей ячейку клеточной суспензии спомощью решетчатых электродов 3 и 4,При включении генератора 8 клеткиориентируются вдоль силовых линийполя и самописец регистрирует резкоеизменение проходящего через ячейкусветового потока, Величина этогоизменения характеризует степеньэлектроориентации клеток. Меняячастоту генератора 8 при постоянном напряжении на электродах ячейки2, получают степень ориентации клеток на разных частотах. Как показывают опыты, величинадля неповрежденных клеток значительно уменьшается, если выбрать напряжение на ячейке соответствующим области насыще Ония эффекта электроориентации поамплитудной.характеристике ячейки,При этом точность измерений значительно уменьшается, В связи с вышеизложенным величину напряжения наэлектродах ячейки выбирают равной20 В, так как для клеток кишечнойпалочки насыщение эффекта электроориентации наступает при напряжениисвыше 35 В и напряжение 10-20 В соот-З 0ветствует линейному участку амплитудной характеристики.Определяют степень электроориентации клеток в поле мегагерцевой4 105 Гц) и килогерцевой (104 Гц)частот и отношение степени электроориентации на этих частотах для сус.пензии интактных (37 С), полностьюповрежденных 61 С) клеток, а такжеклеток иэ суспензий, инкубировавшихся при промежуточных температурах,По выражению (1) рассчитывают про-цент неповрежденных микроорганизмовв анализируемых образцах.Полученные данные приведены втабл. 1,Результаты определенияповреждения микроорганизмов, % Из табл, 1 видно, что с увеличением температуры инкубации величиныи М уменьшаются, что связано с увеличением числа поврежденных клеток.П р и м е р 2 ,Исследуют тепло. вое повреждение грамположительных бактерий Вас 122 цз СЬцг 1 пепаа шт,26, Клетки инкубируют при температуре от 26 до 55 ОС в течение 20 мин. Удельная электропроводность суспензии 2 10Ом 1 мрН 6,0, Напряжение на электродах ячейки 15 В.Установка, на которой проводят измерения, и последовательность операций аналогичны примеру 1.Результаты приведены в табл,2,Таблица 2 Из табл,2 видно, что и в этомслучае с увеличением температуры ве.личины Р и Ж уменьшаются, что свидетельствует о повреждении клетокпри нагревании,П р и м е р 3. Исследуют тепловое повреждение грамотрицательныхбактерий Расцйовопаа асгц 81 пояа,Клетки инкубируют при температуреот 37 до 61 О С в. течение 20 мин,Удвльная электропроводность суспензии 10Ом 1 м , рН 6,0, Напряжениена электродах ячейки 15 В,Установка, на которой проводятизмерения, и последовательностьопераций аналогичны примеру 1.Результаты представлены в табл.3.И в этом примере повреждение кле ток при нагревании приводит к умень шению 3 и сс,Использование предложенного способа определения повреждения микро организмов обеспечивает в сравнении с известным количественную оценку числа жизнеспособных клеток, а значит, увеличение точности ана ,лиза. Следует также отметить, что при анализе бактериальных клеток небольшого размера (менее 10 м) применение известного способа невозможно в связи с тем, что размеры таких клеток находятся на пределе разрешения светового микроскопа и визуальный анализ их поведения в поле невозможен, Предложенный способ при 1 меним для анализа и таких мелких клеток.