Способ получения стафилококкового энтеротоксина типа а

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТАФИЛОКОККОВОГО ЭНТЕРОТОКСИНА ТИПА А, включающий отделение токсинсодержащей культуральной жидкости, ультрафильтрацию и очистку ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-и КМ-целлюлозе, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения выхода целевого продукта, токсинсодержащую культуральную жидкость отделяют микрофильтрацией в тангенциальном потоке на капроновых мембранах с размером пор 0,22 мкм, а ультрафильтрацию проводят последовательно на полисульфонамидных мембранах с порогом пропускания 100 и 30 кД.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению энтеротоксина типа А.
Цель изобретения является упрощение способа очистки токсина и повышение выхода целевого продукта.
П р и м е р 1. I этап. Выделение и концентрирование токсинсодержащей фракции.
Бактериальную суспензию непосредственно из ферментера подают при помощи перистальтического насоса в фильтрационную установку, заправленную кассетой из микропористых капроновых мембран с размером пор 0,22 мкм.
Скорость подачи регулируют так, чтобы рабочее давление внутри аппарата составляло 0,08-0,12 МПа. Осветленную культуральную жидкость собирают в отдельную емкость, а концентрат бактериальных клеток поступает обратно в ферментер, завершая цикл рециркуляции. Исходную бактериальную суспензию концентрируют до объема 0,3-0,4 л и дважды подвергают диафильтрации, разводя концентрат 0,15 раствором NaCl в соотношении 1:3. Полученную в ферментере бактериальную взвесь обезвреживают. Осветленную культуральную жидкость подают при помощи второго перистальтического насоса во второй фильтрационный аппарат, заправленный кассетой из ультрафильтрационных полисульфонамидных мембран УПМ-П, имеющих порог пропускания 100 кД. Рабочее давление внутри аппарата не должно превышать 1 МПа. Получаемый ультрафильтрат собирают в отдельную емкость и по мере его поступления подают при помощи третьего перистальтического насоса в третий фильтрационный аппарат, заправленный ультрафильтрационной кассетой РТТК 000 05, имеющий порог пропускания 30 кД. Скорость подачи регулируют так, чтобы рабочее давление внутри аппарата составляло 0,08-0,1 МПа. Получаемый пермеат отбрасывают, а концентрат токсинсодержащую фракцию дважды подвергают диафильтрации с дистиллированной водой, добавляемой в соотношении 1:3. Конечный объем концентрата 400 мл.
Очистка от неспецифического белка на данном этапе составляет 99,6% выход целевого продукта 84,5% от исходного (см.табл.1). Полученная белковая фракция на 60,2% состоит из энтеротоксина, но содержит также значительное количество пигмента, который удаляют ионообменной хромотографией на ДЭАЭ-целлюлозе.
II этап. Исключающая сорбция на ДЭАЭ-целлюлозе.
Концентрат токсинсодержащей фракции доводят до рН 7,0 и пропускают со скоростью 3-5 мл/мин через колонку (2,5 х 50 см) с древесной волокнистой ДЭАЭ-целлюлозой, предварительно уравновешенной 0,05 М НФБ (рН 7,0). Первую фракцию, равную объему колонки и не содержащую белка, отбрасывают. Остаточный объем токсинсодержащей жидкости вытесняют из колонки дистиллированной водой и присоединяют к основной белковой фракции.
Очистка от неспецифического белка на данном этапе возрастает до 99,96% чистота препарата до 93,5% выход СЭА составляет 77,8% от исходного (табл.1).
III этап. Ионообменная хромотография на КМ-целлюлозе.
Токсинсодержащую жидкость с целью уравновешивания ионной силы разводят дистиллированной водой в соотношении 1:5 и доводят рН до 6,0, после чего в раствор добавляют порошковую КМ-целлюлозу ("Реанал", сухая масса 20 г), предварительно уравновешенную 0,01 М НФБ (рН 6,0). Смесь перемешивают механической мешалкой в течение 1 ч и пропускают через фильтр Шотта. Собранную целлюлозу с сорбировавшимся токсином переносят в хроматографическую колонку (1,8 х 20 см) и промывают 0,01 М НФБ (рН 6,0) до нулевого показания УФ-детектора, после чего проводят десорбцию энтеротоксина 0,045 М НФБ (рН 6,5).
Конечная очистка токсина от неспецифического белка составляет 99,99% чистота препарата 99,8% выход 57,2% от исходного (см.табл.2).
Очищенный энтеротоксин разводят в 4,5 раза дистиллированной водой, а затем 0,01 М НФБ до коммерческой концентрации (100 мкг/мл).
Полученный препарат СЭА обладает строгой моноспецифичностью и преципитирует в реакции двойной гель-диффузии только со стафилококковой антиэнтеротоксической сывороткой типа А "Серва".
Дисковый электрофорез в ПААГ-ДСН показал, что очищенный предлагаемым способом СЭА содержит один компонент и является гомогенным.
Таким образом, данный способ является менее трудоемким за счет применения более технологической каскадной ультрафильтрации и позволяет получать стафилококковый энтеротоксин типа А высокой степени очистки и при большем выходе целевого продукта.
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению энтеротоксина типа А. Целью изобретения является упрощение способа очистки токсина и повышение выхода целевого продукта. Токсинсодержащую фракцию выделяют каскадной микро- и ультрафильтрацией в тангенциальном потоке жидкости. После чего проводят доочистку токсина методом ионообменной хроматографии. Данный способ позволяет повысить выход высокоочищенного энтеротоксина типа А, при этом исключается очистка токсина на гидроксиапатите. 2 табл.