Способ идентификации возбудителя брюшного тифа

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 5 С 120 ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОВЕДОМСТВО СССР(ГОСПАТЕНТ СССР) ЗОБРЕТ ПИСАН ЕЛЬСТВУ К АВТОРСКОМУ СВИ 1 ., 2(46) 15.12.92. Бюл. 3 Ф 460,3-0,4; натрия тиосульфат О,(71) Районная санэпидстанция, г. Проле- моловый синий(0,2-ный во тарск Ростовской области. 11-12 мл, вода дистиллиров(56) Методические указания по микробиоло"С, отбирают культуры, да. гической диагностике заболеваний, ызыва- отрицательную реакцию, иер емых энтеробактериями, М 1984, с. 24-35, дифференцирующий биохи определяют серологически(54) СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИЙ ВОЗБУ- бельныесвойстваиинденти ДИТЕЛЯ БРЮШНОГО ТИФА; туры по совокупности(57) Использование: микробиология, иден- . характерных для бактЕрий б тификация энтеробактерий, бактериологи- Способ дает возможность в ческая диагностика. Сущность изобретения: не диагносцируемую извест на комбинированных 2 и 3 сахарных средах значительную группу типич дополнительно отбирают лактозоположи- брюшного тифа с нескольк тельные, не образующие газ и сероводород пределах естественной вари культуры. Пересевают их на скошенную со тивностью протеолитических столбиком лактозную среду, содержащую фермента тиосульфатредуктамикробиолоо ири идентипособ идентиого тифа, выМетодические еской диагноых энтеробакносится ользова ерий. ческий с я брюш рототип биологич ызываем и являеть эначиктерий енной в льности ермента омбиниельную ноотри- роводоутем посева ды обогащена селективпосевом ых колонййванные срео совокупновляется и ала на сре пересевом е среды рицательн комбиниро и культур п овышеИзобретение от гии и может быть иси фикации энтеробактИзвестен класси фикации возбудител бранный нами за и указания по микро стикезаболеваний, втериями).Способ осущест исследуемого матер ния с последующим ные пластинчаты выросших лактозоо на 2 или 3-сахарные ды и идентификацие углевод 10 - 15; игидрофосфат 2-0,3, бромтидный раствор) анная до 1 л, вы 24-72 ч при ющие лактозоесевают их намический ряд,.е и фаголизафицируют кульпризнаков, рюшного тифа. ыявлять ранее ным способом ныхбактерий о сниженной в абельности акферментов и зы. 5 табл. сти биохимических, серологических лизабельных свойств,Недостатком данного способа ся невозможность диагностироват тельную группу типичных ба брюшного тифа с несколько сниж пределах естественной вариабе протеолитической активностью ф тиосульфатредуктазы, дающих на к рованных средах ложноположит оценку лактозного признака и лож цательную - признака продукции се рода.Целью изобретения является п ние точности способа.до 1 л7,2-7,4 Цель достигается путем дополнительного отбора из комбинированных средахлактозоположительных, не образующих гази сероводород культур, пересева на скошенную со столбиком лактозную среду, содержащую, г/л:Агар 8-9Пептон 2-3Углевод 1.0-15Натрия хлорид 4-5Калия дигидро. фосфат 0;3-0,4Натрия тиосульфат 0,2-0;3Бромтимоловыйсиний (0,2 водныйраствор) 11-12Вода дистиллированная до 1 лрН " 7,2-7,4,инкубирования посева при 37 С (24-72 ч),пересева культур, учтенных на предЛоженной среде как лактозоотрицательные, насреды биохимического ряда; в котором сахаролитические свойства определяют наскошенных со столбиком моноуглбводныхсредах (маннит, сахароза, дульцит, арабикоза и др,), а признак образования сероводорода на среде типа Клиглера прикультивировании при 37 С не менее 4-5 суток с ежедневным контролем" ,определениясерологических и фаголизабельных призна ков и идентификаций культуры йо совокупности признаков, характерных дляЗа вопеИа турЫ,П р и м е р 1, Исследуемый материалзасевают в среды накопления, инкубйрУютв течение 18 - 24 часов при 370 С. Пересеваютна пластинчатые селективные среды. Культивируют при 37 С в течение 20-24 часов.Выросшие лактозоотрицательные колониипересевают на 2-х или 3-х сахарные комбинированные, среды тйпа Клиглера. Культивируют при 37 С в течение суток. Отбираютлактоэоположительные, не образующие гази сероводород культуры и пересевают их наскошенную со столбиком"лактозйую питательную среду, содержащую, г/л:Агар 8-9Пептон 2-3Углевод10-15НаТрия Млорид4-5Калия дигидро-фосфат 0,3-0,4Натрий тиосульфат 0,2-0,3Бромтимоловый синиймл, стерилизуют при 0,5 избыточной атмосферы при 112 С в течение 20 мин. Послестерилизации пробирки оставляют в слегканаклонном положении для получения "ско 30 шенного столбика". В готовом виде средаимеет травянистый цвет,Применение среды: Испытуемую культуру засевают штрихом по скосу и уколом встолбик среды, После культивирования при35 37 С в течение суток производят учет теста,В зависимости от степени активности определяемого сахаролитического фермента кмоменту учета возможны следующие варианты:40 При высокой степени активности - среда в скосе и в столбике; колонии на скосеокрашиваются в желтый цвет.При средней степени активности - вжелтый цвет окрашиваются лишь колонии45 на скошенной части среды,При слабой степени активности в случаезамедленной ферментации среда сохраняетзеленую окраску и окончательно тест следует учесть через 48-72 часа.50 Иэ данных табл. 2 видно, что у некоторых испытуемых культур ферментация углеводов (лактозы) происходит только вотносительно анаэробных условиях столбика среды. В этом случае тест оценивают как55 положительный при переходе окраски встолбйке среды из зеленой в ярко-желтуюпри одновременном появлении синей окраски в скошенйой части, Гаэообразованиеучитывают в столбике по появлению пузырьков, разрывов среды. 5 10 15 20 25 Посевы инкубируют 24-72 ч при 37 С, отбирают лактозоотрицательные культуры, засевают их на биохимический ряд, в котором расщепление маннита, сахарозы, ксилозы, арабинозы, дульцита, сорбита определяют посевом на скошенные со столбиком моноуглеводные среды, а продукцию сероводорода инкубированием культуры на среде Клиглера с ежедневным контролем не менее 4-5 сут. Определяют серологические и фаголизабельные признаки и идентифицируют культуру по совокупности всех признаков.П р и м е р 2, Приготовление моноуглеводной скошенной со столбиком среды.Навеску хлорида натрия, углевода, пептона и двухэамещенного фосфата калия, гипосульфита предварительно растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды. В оставшейся дистиллированной воде при помешивании и подогревании до закипания растворяют агар. Затем все ингредиенты соединяют, перемешивают и добавляют индикатор. Устанавливают рН=7,2 - 7,4. Разливают в пробирки по 7 - 81781299Энтеробактерии, не расщепляющие со- Из данных табл,1 видно, что оптимальответствующий углевод, окрашивают скос ным является следующий состав среды, г/л:среды в синий цвет за счет образующихся в Агар 8-9небольшом количестве щелочных продук- Пептон 2-3тов протеолиза. более интенсивно протека Углевод 10-15ющего в аэробных условиях скоса, Натрия хлоридСохранение зеленой окраски или слабое не- Калия дигидрофосфат 0,3-0,4специфическое пожелтение столбика при . Натриятиосульфат 0,2-0,3одновременном окрашивании скоса среды бромтимоловыйв синий цвет оценивают как отсутствие со синий (0,2 6 водныйответствующего фермента у испытуемых "раствор) 11-12бактерий. Вода дистиллированная До 1 лП р и м е р 3. Среда с минимальными рН 72-74значениями ингредиентов.Уменьшение концентрации ингредиенСреду готовят по примеру 2. Получен товнеблагоприятнодляжизнедеятельностиная среда имеет следующий состав, г/л: и выявления ферментативных способностей8 микробов, Увеличение концентрации ингре 2 диентов ведет к чрезмерному осмотическо 1.0 му давлению в среде, что также затрудняетНатрия хлорид4 20 жизнедеятельность и выявление ферментаНатрия тиосульфат 0,2 тивной способности микроорганизмов.Калия дигидрофосфат 0,3 Из сравнительных данных табл, 2, 3 наБромтимоловый приме:е определения расщепления лактосиний (0,2 водный зы на среде Гисса с лактозой, среде Клигле 11 25 ра и предлагаемой скошенной среде сВода дистиллированнаяДо 1 л лакто;ой видно, что последняя обладает нарН 7,2-7,4 ибол,-,шей чувствительностью,Данные по идентификационным свой- Из данных табл. 3 видно, что для ферствам среды см, в табл, 1, - ментации углеводов (лактозы) у некоторыхП р и м е р 4. Среда с оптимальнйми 30 энтеробактерий имеет значение степеньзначениями ингредиентов;- анаэробности условий. Для доказательства.Среду готовят по примеру 2. Получен- этого положения испытуемйе культуры, учная среда имеет следующий состав, г/л; тенные на среде Клиглера как лактозоотри 8,5 цательные, пересевают для оценки,2,5 35 лактозного теста на скошенную со столби 12,5 ком агаризованную среду Гисса с лактозой:.Натрия хлорид4,5 (г. Махачкала НИИ по производству питаТиосульфат натрия 0,25 тельных сред) и скошенную со столбикомКалия дигидрофосфат 0,35 лактозовую среду.Бромтимоловый 40 П р и м е р 6, Сравнительная оценкасиний(0,2 -.ный водный ферментации лактозы на средах Клиглера,11,5 Гисса и скошенной лактозной среде(табл.2).Вода дистиллированная до 1 л П р и м е р 7. Влияние на метаболизмрН 7,2-7,4 лактозы аэробных (скос среды) и относиДанные по идентификационным свой тельно анаэробных условий (столбик срествам средысм. в табл. 1, ды) (табл.3),Для сохранения форм "скошенный столП р и м е р 5. Среда с максимальными бик" в среду Гисса при приготовлении дозначениями ингредиентов. бавляют в количестве 8 г/л агар.Среду готовят по примеру 2, Получен Основываясь на полученных данных,ная среда имеет следующий состав(г/л):, представленных в таблице 2 и 3, можно. 9 утверждать, что использование скошен- .3 ной со столбиком моноуглеводной. среды15 позволяет более достоверно определитьНатрия хлорид . 5 55 расщепление углевоДов при вариабельной0,3 активности соответствующего фермента,Калия дигидрофосфат 0,4 получить полуколичественную оценку тестаБромтимоловый синий: 12 и определить ферментативный (в относиВода дистиллированная До 1 л тельно анаэробных условиях столбика) и рерН 7,2-7,4спираторный (в условиях скошенной части)характер утйлизации углеводов.Более чем семикратная разница вконцентрации углевода и пептона позволяет избежать маскирующего влияниящелочных продуктов протеолиза и создатьпреимущественные условия для образующихся кислых продуктов расщепления углеводов,П р и м е р 8, Влияние срока экспозиции-на продукцию сероводорода у штаммов Я.урЫ на среде Клиглера. -П р и м е р 9, Влияние срока экспозициина эащелачиванйе скошенной части Клиглера при культивировании Я. турЫ.Таким образомсрок экспозиции культур 3. турЫ на средах типа Клиглера в 4 - 5сут является оптимальным, т.к. он достаточен для вьгявления признака образованиясероводорода. Уменьшение срока, ведет кложноотрицательной оценке признака образования Сероводорбда; увеличение экс позиции может привести к гибели культуры.П р и м е р 10. У больного В., у которогопри"оперативном вмешательстве установлена перфорация кишечника с пбдозрениемна брюшнотифозную этиологию, была взятапроба крови в количестве 12 мл. Произведенпосев в 150 мл желчного бульона, Через 48часов инкубации при 37 С был произведенвысев из желчного бульона на среду Энда.Через 18 часов инкубирования при 37 С насреде Эндо выросли мелкие бесцветные колонии, которые были пересеяны на комбинированную дифференциальную средуОлькельницкого, Через 24 часа инкубйрования при 37 С на скосе среды выросли мелкие изолированные колонии. Скос и столбиксреды изменили розовую окраску на желтую, газообразование и продукция сероводорода отсутствовали. Культуры былиоценены как ферментирующие глюкозу,лактозу, не продуцирующие газ и сероводород и не подлежащие дальнейшему исследованию согласно общепринятой схемеклассического способа,Культуры были пересеянына скошенную со столбиком лактозную среду, см. пример 1, Через 24 ч инкубирования при 37 Скультура была оценена как лактозоотрица-тельная (см. пример 2) и пересеяна на средуОлькельницкого и среды. биохимическогодифференцирующего ряда, в котором оценкатеста расщепления углеводов производиласьна скошенных со столбиком углеводных средах с соответствующими углеводами (маннит,сахароза, дульцит, ксилоза, арабиноза,сорбит, рамноза).Через 72 ч инкубирования культуры насреде Олькельницкого отмечалось защелачивание скошенной части среды и продуцирование сероводорода.После оценки тестов на средах дифференцирующего ряда культуры были оценены как неферментирующие лактозу, сахарозу,дульцит, рамнозу, ферментирующие глюкозу, ксилозу, арабинозу, маннит, сорбит, декарбоксилирующие лизин, не образующиеиндол, не утилизирующие цитрат и малонат10 натрия, продуцирующие сероводород, подвижные грамотрицательные палочки, агглютинирующиеся сальмонеллезнойсывороткой 09 и Ч 1, Нб, лизирующиесябрюшнотифозным бактериофагом.15 По совокупности этих признаков онибыли идентифицированы как бактериибрюшного тифа, что нашло подтверждениепосле повторной идентификации в Ростовской-на-Дону областной баклаборатории,20 где выделенная культура была отнесена кфаговару Е 1, второму ферментативному типу.Указанный пример иллюстрирует вероятность диагностической ошибки при ис 25 пользовании комбинированных сред и" повышение точности исследования приприменении предложенного способа,П р и м е р 11. Проба мочи в количестве50 мл доставлена в лабораторию при обсле 30 довании Н, общавшегося с больным В.Был произведен прямой посев на средуПлоскирева, Эндо. Через 20 ч на этих средахвыросли мелкие бесцветные колонии, которые были пересеяны на среду Клиглера, ин 35 кубировались при 37 С. Через 24 ч снятыекультуры были оценены как лактозоположительные, не образующие газ и сероводород.Культуры были пересеяны на лактозную скошенную со столбиком среду и культивирова 40 лись при 37 С втечение 24 ч и были оцененыкак лактозоотрицательные, Культуры быливновь пересеяны на среду типа Клиглера(предприятие центрального НИИВС им. И.И. Мечникова) и среды биохимического диф 45 ференцирующего ряда, Через 48 часов инкубирования на среде Клиглера отмечалосьзащелачивание скоса среды и продукция сероводорода,По результатам испытания на средах50 дифференцирующего ряда, включая скошенные со столбиком моноуглеводные среды,культуры по совокупности биохимических, серологических и фаголизабельных признаковбыли оценены как брюшнотифозные. После55 повторной идентификации в Ростовскойна-Дону областной баклаборатории культура была отнесена к фаговару Е, второмуферментному типу.П р и м е р 12, Проба испражненийбольного энтероколитом в количестве 1 г1781299 10 была засеяна в селенитовый бульон на чашки со средой Плоскирева и Эндо. Через 20 часов инкубации при 37 С на среде Эндо и Плоскирева выросли мелкие бесцветные колонии, которые были пересеяны на среду типа Клиглера. Культуры культивировались при 37 С 24 ч и были учтены как лактозоположительные, не образующие газ и сероводород, и пересеяны на скошенную со столбиком лактоэную среду. Через 24 ч культивирования при 37 С культура была учтена как лактозоположительная и не подлежащая дальнейшей идентификации на бактерии брюшного тифа.Этот пример иллюстрирует, что в дан. ном случае оценка лактозного теста на среде Клиглера была достоверной,Таким образом, использование предлагаемого способа дает возможность выявлять путем дополнительного отбора на 2-и 3 сахарном агаре лактозоположительных, не образующих газ и сероводород культур, и пересева их на лактозную скошенную со столбиком питательную среду, ранее не диагносцируемую значительную группу бактерий брюшного тифа и назначить соответствующее этиотропное лечение и провести своевременно необходимые противоэпидемические мероприятия.формула изобретения Способ идентификации возбудителя брюшного тифа путем посева исследуемого Таблица 1 Данные по идентификационным свойствам среды Учтены как лактоэоположительные на с е ах; С максимальным значением ингре- иентов С оптимальным значением ингре- иентов С минимальным значением ингре- иентов Клиглера Гисса 21 25 О 11 9 22 26 0 12 10 20 24 0 10 8 0 О О 0 0 12 8 0 2 0 44 26 12 12 20 СсгоЬастегЕптегоЬастег,ЯагпопеИаКеЬзеИаЯЬ, зоппе Таблица 2 Количество культур скошенной: Гисса: абс абс и о ент и о ент 82,9 82,9 577 575 0 17,220500 Род испытуемых эн- Количесттеробактерий во штам- мов Группа культур по характеру роста на среде Клиглера Лактозопоэитивные, не продуцирующие газ и сероводород, в т.ч. идентифицированные как 3. турЫЛактозонегативные, газообразующие, не продуцируюиесе ово о о материала на среды обогащения с последующим пересевом на селективные пластинчатые среды, пересевом выросших лактозоотрицательных колоний на двух"или 5 трехсахарные среды и идентификациейкультур по совокупности биохимических,.серологических и фаголизабельных свойств, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности способа, дополнитель но отбирают на комбинированных средахпервичной идентификации лактоэоположительные, не образующие газ и сероводород культуры, пересевают на скошенную со столбиком лактоэную среду, содержащую, 15 г/л:Агар 8-9 Пептон 2 - 3 Углевод 10-15 Натрия хлорид 4-5 20 Калия дигидрофосфат 0,3-0,4Натрия тиосульфат 0,2-0,3 Бромтимоловый синий0,2-ный водный раствор 11 - 12 Вода дистиллированная . до 1 л 25 рН 7,2-7,4,инкубируют в течение 24-72 ч, отбирают лактозоотрицательные культуры, определяют сахаролитические свойства на скошенных со столбиком моноуглеводных средах, а 30 продукцию сероводорода - на средах типаКлиглера в течение 24-120 ч. Учтены как лактозоположительные на с е ах:Группа культур похарактеру роста насреде Клиглерэ Гисса: скошенной: абс,абс. процент процент 16 0 0 О. 0 099 2 222.468954 1,1 3445,8 0031,7 477 31,5 185 12,2 Таблица 3 Характер роста насреде Клиглера Кол-во культур Гисса: лактозной: по кислотоо 6, в скосе и стол- бике всего по кислотооб. в стол- бике всего по кислотооб. в скосе и стол- бике по кислотооб, в стол- бике Лактозоотрицательные, газообразующие, продуцирующие сероводород Лактозоотрицательные, газообразующие, не продуцирующие сероводородВсего 89 222 128 147 66 49 21 17 369 194 148 127 81 46 Таблица 4 Лактозонегативные, не продуцирующие газ и продуцирующие сероводород, в т.ч. идентифицированн не ка к Я аеопеПа турЫЛактозонегативные, газообразующие, продуцирующие сероводород, в т.ч. идентифицированные как ЯагпопеИаЛактозонегативные, не продуцирующие газ и сероводород, в т.ч, идентифицированные как ЗЫдейа Неферментирующие Всего испытано культур, в т.ч. лактозонегативных по оценке на комплексной сре- де Учтены как лактозоположительные на с е ах: Учтены как лактозоположительные на с е е13 1781299 14 Таблица 5 Появление за елачивания в с оки, ч 24 48 72 96 120 22 12 6 1 Редактор Заказ 4256 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раущская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Количествоштаммов Составитель И. ПодплетеннаяТехред М.Моргентал Корректор Н. Гунько