Способ получения диплоидных апомиктов табака душистого

(51 ИЯ ф РЕТЕ ЕЛЬСТВ АВТОРСКОМУ СВ Я ДИПЛОИДНЫХ ШИСТОГО ехнология, цвето- ость изобретения: табака душистого при опылении мацесмесью, содерпыльцу табаканую пыльцу петуении 1;1. 1 табл. бол го щи рас мо му вкл ния выв нас мик одн мат ког тся ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНВЕДОМСТВО СССРГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗ(71) Киевский медицинский институт им.акад.А.А.Богомольца(56) Тодуа В.А., Тавдумадзе К.Р. Использование ионизирующих излучений для получения гаплоидов табака,//Апомиксис иселекция. - М,: Наука, 1970. с, 283-291,Дарлингтон С.Д Ла Кур А,Ф. Хромосомы, Методы работы, - М,; Атомиздат, 1980,с.х 211.ЮЯ 0,3, Ма 1 готогр)у и чсо 1 апагцмса//НегесИу, - 1977, ч. 39, и, 4, р, 287 -295,)чТзсЬ С, .а сцтцге Ь роиеп зое зцгаеац зупйеТ 9 це//Согпр 1. йепб. Асад.ЯС.(Рагз). Бег.О. - 1974, ч, 278, п,8, р. 1031.Яеиег В,Г., Вачча К.Я.//Рчае белет.,1971, ч.20, и. 1-2, р. 15-25,Изобретение относится к биологии. а именно к прикладной генетике, и может быть использовано в селекции и в цветоводстве для получения диплоидных апомиктов материнского происхождения у цветковых растений с целью их дальнейшего использования в качестве исходного материала для создания высокогомозиготных, или чистых линий, а также сортовыведения.Важной задачей современной генетики и селекции цветковых растений и, в частности табака, является разработка быстрого, простого и эффективного метода получения высокогомозиготных растений, который заменил бы широко применяющийся в настоящее время метод продолжительного инбридинга в ряде поколений из-эа его значительной трудоемкости, В этой связи наи 1787385 А 1(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИ АПОМИКТОВ ТАБАКА ДУ (57) Использование: био водство, мутагенез. Сущн диплоидные апомикты получают прямым путем теринских растений пыл кащей облучен ную душистого инеоблуче нии гибридной в соотнош е перспективен метод индуцированноиплоидного йартеногенеза, позволяю- получать генетически устойчивые ения с удвоенным материнским гено- . 4 которые не подвержены генетическо- Ырасщеплению в дочерних поколениях, лоидные апомикты могут быть сразу ючены в процессе семенного размножедля производства чистых линий и сортоедения. Однако, существующие в оящее время способы получения апотов цветковых растений не позволяют оэтапно получать диплоидные апомикты еринского происхождения.Известен способ, согласно которому чение диплоидных апомиктов материно происхождения у табака осущестгляв два этапа. В начале в результатесамоопыления гамма-облученной в дозе 7 Гр пыльцой получают гаплоидные семена, а затем путем колхицинирования по методу переводят эти семена на диплоидный уровень,Метод имеет ряд существенных недостатков. Во-первых. это необходимость проведения скрининга полученного семенного потомства с целью выявления гаплоидных семян. Во-вторых, потребность в диплоидизации семян при помощи высокотоксичного ядохимиката колхицина, что сопряжено с опасностью в работе и трудозатратами на отработку методики колхицинирования,Известен способ прямого получения диплоидных апомиктов табака путем опыления гамма-облученной в дозе 200 Гр пыльцой, Основным недостатком метода является возможность его применения только к табаку-махорке и очень низкий выход диплоидных апомиктных семян (2 семени на 10 опылений),Известен способ получения диплоидных апомиктов табака с помощью культуры ткани при культивировании микроспор и последующего перевода гаплоидных проростков на диплоидный уровень колхицинированием. Метод имеет ряд недостатков, которые связаны с большими денежными и временными затратами на получение гаплоидных проростков в искусственных условиях, необходимостью проведения скрининга потомства с целью идентификации гаплоидов среди анеуплоидов. Кроме того, сохраняется определенная опасность в работе из-за использования колхицина для целей диплоидизации. Полученные диплоидные апомикты имеют, однако, не материнское, а отцовское происхождение. Наиболее близким по технической сущности из известных способов получения Диплоидных материнских апомиктов является способ.Согласно этому способу получение дигаплоидов производится поэтапно. Сначала получают гаплоиды в результате опыления растений смесью пыльцы, состоящей из собственной, облученной в дозе 1000 Гр, и чужеродной, взятой с растений другого вида этогОже рОда,"которые проявляли перекрестную межвидовую несовместимость в пестике с опыляемым растением, причем объединение геномов в гибриде не препятствовало эмбриональному развитию, Цель достигалась применением в опылении сме"си пыльцы, где отношение облученного и необлученного компонентов было 4:1. Метод был успешно апробирован только на50 55 Облучение собственной пыльцы душистого табака в дозе 1000 Гр при мощности 0,2 Гр,с лишало ее оплодотворяющей способности, что гарантировало отсутствие образования жизнеспособных семян вследствие самобплодотворения. Использование способа позволяет избежать применение колхицина, а также временных и трудовых затрат на перевод гаплоидных растений на дигаплоидный уровень и дает ряд дополнительных преимуществ, которые будут раскрыты ниже,Способ осуществляют следующим образом. тополях, После получения семенного потомства и проведения скрининга на присутствие гаплоидов выявленные гаплоиды обрабатывали колхицином и получали диплоиды.Настоящий метод не требует использования техники культуры ткани и позволяет получать апомикты непосредственно в опылении. Однако настоящий способ обладает недостатками, которые лимитируют его повсеместное применение, поскольку он не является прямым и не позволяет сразу получать диплоидные апомикты уже в опылении, что обусловливает необходимость последующего использования в работе опасного ядохимиката колхицина.Целью изобретения является одноэтапное, или прямое, получение диплоидных семян материнского происхождения у цветковых растений, например, табака душистого, в результате проведения опыления пыльцесмесью из собственной облученной и чужеродной несовместимой, но жизнеспособной и ыльцы.Укаэанная цель достигается тем, что визвестном способе получения материнских апомиктов, включающем сбор пыльцы с пыльников, ее высушивание в комнатных условиях, облучение гамма радиацией Со в дозе 1000 Гр/с и смешивании с предварительно высушенной таким же образом, но необлученной пыльцой петунии гибридной в равных соотношениях. Отличительным признаком заявляемого способа является режим проведения опыления пыльцесмесью, в которой компоненты берутся в равных соотношениях, а необлученная пыльца в данной системе опыления проявляла как пестичную, так и зиготическую несовместимость. Последнее сказывалось на полной невозможности образования семян посредством амфимиксиса иэ-за расщепления геномов у гибридов и постепенной элеминации хромосом, что приводило к ран ней гибели гибридных зародышей,Собирают пыльники табака и петунии душистого, Кастрированные цветки табака перед началом антезиса, т.е. перед самым размещали под изоляторами, которые снираскрытием, помещают в чашки Петри на 30 мали лишь спустя 10 дней после опыления, ч при температуре 26 С. Путем быстрого Из собранных плодов вытрушивали семена ручного перемещения чашек Петри в раз и помещали их в бумажные пакетики. После ные стороны производят отделение пыльцы хранения в течение 1 мес семена проращиот пыльниковой ткани, после чего высушен- вали в чашках Петри на влажной фильтроную пыльцу переносят в закрытые бюксы и вальной бумаге при температуре 25 ОС. хранят при -20 С. Проросшие семена переносили затем в усПыльцу табака душистого перед опыле ловия почвенной культуры в горшки, набинием облучают в закрытых бюксах пбои тем- тые землей, и все размещали в теплице. пературе 20 С гамма-лучами Со и рио оТаким образом, удалось вырастить полмощности дозы 0,2 Гр/с в дозе 1000 Гр. ноценные растения, фенотипически иден- После облучения производят смешивание тичные материнским. Как видно из таблицы, равных частей облученной пыльцы табака 15 проведение опыления пыльцесмесью (1;1), душистого с необлученной пыльцой пету- которая состояла из равных количеств слании гибридной. Полученной смесью опыля-, гающих ее компонентов, позволяет полют растения табака душистого, причем учить стабильное плодообразование, предварительную кастрацию растений про- сопровождающееся появлением семянраз- водят за 1-2 дня доопыления, когда на них 20 ных типов - нормальных с зародышем и одевают изоляторы, Облучение и опыление эндоспермом; фенотипически нормальных, проводят в утренние часы. Для удобства но пустых из-за деградации эмбриональных применения способа возможно также вре- тканей, а также полностью разрушенных семенное хранение облученной пыльцы сро- мян, Кроме того, встречались и абортивные комдодвухсутоквхолодильникеприС. 25 семена с остатками зародыша или зндосПосле проведения опыления на растения перма. В среднем в опылении образовываснова одевают изоляторы, которые затем лось до 8 нормальных диплоидных семян, снимают через 10 дней, Полученные в опы- имеющих апомиктное происхождение, лениях семена оставляют храниться в,ком- Сравнительно низкий показатель всхокенатных условиях в бумажных пакетиках 30 сти семян указывает на присутствие в сесроком на 1 мес. После этого семена прора- менном потомстве после опыления щивают на влажной фильтровальной бумаге высокого процента пустых семян с деградив чашках Петри при 25 С, Проросшие семе- ровавшими зародышевыми тканями.на переносят в горшки с почвой, т.е, непос- П р и м е р 2. Сбор пыльцы петунии редственно в условия почвенной культуры. 35 гибридной и табака душистого проводилиСущность заявляемого способа можно по методике, описанной в примере 1. Высупроиллюстрировать таблицей, в которой шенную пыльцутабака облучали в закрытых раскрыто влияние режима опыления и со- бюксах пбои температуре 20 С гамма-радиастава пыльцесмеси на образование дипло- циейСо в дозе 1000 Гр при мощностиоидных апомиктов табака душистого, 40. 0,2 Гр/с. Затем сразу готовили пыльцесП р и м е р 1. С растений табака души- месь (4:1) путем смешивания 4 ч. облучен- стого и петунии гибридной собирали пыль- ной пыльцы табака с 1 ч пыльцы петунии никиперед началом антезиса и помещали в гибридной. Этой пыльцесмесью проводили чашки Петри в условиях комнатной темпе- опыление предварительно кастрированных ратуры и 600-ной влажности воздуха на 30 45 за 1 - 2 дня до опыления цветков табака дуч. После этого с помощью ручного переме- шистого, помещенных под изоляторы, По- щения чашек Петри из стороны в сторону сле появления плодов изоляторьг убирали, обеспечивали отсоединение пыльцы от Собранные семена выдерживали в течение пыльниковой ткани и ее концентрирование месяца в бумажных пакетиках с целью маку края чашки, что облегчало сбор пыльцы и 50 симальной активации их прорастающей ее перенос с помощью скальпеля в бюксы. способности, Проращивание семян провоПыльцу табака душистого облучали гам- дили на влажной фильтровальной бумаге в ма-радиацией Со вдоэе 1000 Грпримощ- чашках Петри при температуре 25 С. Проностидозы 0,2 Гр/свтечение 83 мин 10 с,а росшие семена переносили в условия поэатем смешивали уже облученную пыльцу с 55 чвенной культуры в горшки с землей и таким равным количеством необлученной нор- образом получали зрелое растение, Как видмальной пыльцы петунии гибридной. Смесь но из таблицы, в данном варианте опыления хорошо перемешивали, а затем использова- наблюдается некоторое снижение плодоли для опыления предварительно кастриро- образования до 95, которое сочетается с ванных за 1-2 дня до этого цветков табака резким падением показателя семяобразо 1787385вания в 6 раз по сравнению с получаемым в опылениях пыльцесмесью типа (1:1). В плодах в основном преобладали разрушенные, пустые и абортивные семена, хотя было получено и значительное количество нормальных семян, способных к прорастанию и давших начало диплоидным апомиктным растениям. По этой причине всхожесть семян снизилась до 3%,П р и м е р 3. Сбор пыльцы петунии итабака, а также облучение пыльцы табака проводили по методике, описанной в примере 1, Для опыления готовили пыльцесмесь из 2 ч. облученной в дозе 1000 Гр пыльцы табака и одной части пыльцы петунии. Опыление,а также проращивание полученных семян проводили по методике, описанной в примере 1. Проросшие семена йереносили в горшки с почвой, которые устанавливали в теплице, что обеспечивало вдальнейшем по. учение сдвоенных растений, являющихся исключительно диплоидными апомиктами. Как видно из таблицы, плодообразование в опылениях достигало 98% и сопровождалось появлением в некоторых случаях до 30 семян в плоде. В то же время в семенном потомстве преобладали пустые и абортивные семена, способные лишь к спорадическому кратковременномупрорастанию без последующего развитияпроростка в растение. Всего в опылениях было получено до 70 полноценных семян, что определило средний показатель выхода диплоидныхапомиктов в пределах 2 на опы-. ление,П р и м е р 4. Сбор пыльцы петунии и табака, а также облучение и чльцы табака проводили по методике примера 1, Пыльцесмесь типа(1:2) для опыления готовили из одной части облученной в дозе 1000 Гр при мощности 0,2 Гр/с пыльцы табака и 2 ч. пыльцы петунии гибридной, Опыление кастрирдванйых растений табака душистого. а также сбор и проращивание семян полученных в опылениях, проводили по методике,описанной в примере 1, Проросшие семена затем доводили до стадии зрелоо растения путемпереноСа в почвенную культуру в горшки с землей, размещенные в теплице, Как видно из таблицы, изменение соотношения компонентов пыльцесмеси в сторону необлученногонесовместимого компонента привело к снижению плодообразования до80%, а также к заметному падению количественного содержания семян в плодах всреднем до 4 на плод, Низкий уровень семя- образования, однако, сочетался с общей высокой всхожестью семян, которая отражала присутствие в семенном потомстве большого процента полноценных семян, Это обес 5 10 20 25 30 35 40 45 50 55 печило сравнительно высокий показатель выхода диплоидных апомиктов в опылении, в среднем равный 1,П р и м е р 5, Сбор пыльцы петунии и табака, а также гамма-облучение пыльцы табака проводили по методике, описанной в примере 1. Для опыления готовили пыльцесмесь типа (1:4), состоящую из 1 ч. обученной в дозе 1000 Гр при мощности дозы 0,2 Гр/с пыльцы табака и 4 ч. пыльцы петунии гибридной, Опыление растений табака, а также сбор и проращивание полученных в опылении семян проводили по методике, описанной в примере 1. Проросшие семена высаживали в горшки с почвой, которые затем выставляли в теплицу, Как видно из таблицы, опыление пыльцесмесью типа (1;4) обусловило снижение плодообразования до 67% при одновременном уменьшении среднего количества семян в плодах до 2. Как оказалось, все семена были пустыми или сильно абортивными, что не позволило получить ни проростков, ни зрелых растений.П р и м е р 6, Сбор пыльцы табака проводили по методике, описанной в примере 1, После этого ее облучали гамма-радиацией Со в дозе 1000 Гр при мощности 0,2 Гр/с в закрытых бюксах при температуре 20 С. Опыление кастрированных растений табака собственной облученной пыльцой проводили в утренние часы. Семена проращивали на влажной фильтровальной бумаге в чашках Петри при температуре 26 С, Как видно из таблицы для этого варианта опылений (тип пыльцесмеси 1:О), жизнеспособных семян в опылениях получено не было,П р и м е р 7, Сбор пыльцы петунии гибридной проводили путем помещения пыльников перед их раскрытием в чашки Петри на 30 ч при температуре 26 С, С помощью ручного перемещения в чашках Петри вытрушивали пыльцу из раскрывшихся пыльников, а затем уже скальпелем ее переносили в закрытые бюксы, Опыляли такой пыльцой кастрированные цветки табака душистого. Как оказалось (см,таблтип пыльцесмеси 0:1) в опылениях не было получено ни плодов, ни семян, что указывает на блокирование роста пыльцевых трубок петунии в пестике табака.из-за существования межродовой инконгруиции, обусловленной различиями в длинах пестиков у петунии и табака.Таким образом, использование заявляемого способа получения диплоидных апомиктов у цветковых растений по сравнению с прототипом обеспечивает получение диплоидных апомиктов в выращенном растительном потомстве, Только использование смеси пыльцы типа(1:1) из собственной гам10 15 20 25 35 40 45 ма-облученной в дозе 1000 Гр при мощности 0,2 Гр/с пыльцы табака и необлученной нормальной пыльцы петунии гибридной, для которой характерно проявление межродовой инконгруиции в пестике табака, обеспечивает достижение намеченной цели, а изменение пропорции компонентов пыльцесмеси влечет резкое снижение эффективности способа, что было продемонстрировано примерами. Появление диплоидных апомиктов табака обеспечивается тем, что пыльцевые трубки гамма-облуценной в дозе 1000 Гр пыльцы табака в процессе самоопыления проникают не во все семяпочки, В этом случае создаются предпосылки для индукции партеногенеза в некоторых интактных семяпочках растущей сзади пыльцой петунии, В случае же осуществления межродового амфимиксиса образование полноценных семян невозможно из-за появления межродовой зиготической несовместимости геномов, ведущей к деструктивным процессам и гибели эмбриоидов. В этой связи появле.ние жизнеспособных семян в опылениях может иметь место только благодаря их партеногенетическому происхождению. Изменение соотношения компонентов в пыльцесмеси в сторону увеличения облученной пыльцы /(2:1) и (4:1)/ приводит к снижению вероятности проникновения пыльцевых трубок петунии гибридной в область семяэачатков, что, в свою очередь, влечет уменьшение потока веществ-индукторов партеногенеза в семяпочки. Последнее негативно сказывается на эффективности опыления и выходе диплоидных апомиктов. В тоже время изменение соотношения компонентов в пыльцесмеси в сторону уменьшения облученной пыльцы /(1;2) и (1:4)/ также обусловливало снижение концентрации пыльцевых трубок петунии гибридной вблизи отдельного семязачатка, что было вызвано как ослаблением менторного эффекта со стороны облученной пыльцы табака, так и увеличением количества интактных семяпочек вследствие уменьшения стерилиэую щего эффекта облученной пыльцы на зародышевые мешки,Использование заявляемого способа позволит получить специалистам-селекционерам целый ряд преимуществ по сравнению с прототипом: во-первых это разработка режима опыления, обеспечивающего одноэтапное получение диплоидных материнских апомиктов непосредственно в процессе опыления пыльцесмесью, состоящей из равных частей собственной облученной в дозе 1000 Гр при мощности 0,2 Гр/с пыльцы табака и пыльцы петунии гибридной, растения другого рода семейства пасленовых. Во-вторых, это полный отказ от применения в экспериментальной работе ядохимиката колхицина, В-третьих - это использование жесткого традиционного режима культивирования семян, который обеспечивает стопроцентный выход диплоидных апомиктов в выращенном растительном потомстве. В-четвертых, это значительная экономия времени из-за отсутствия необходимости в проведении цитологического скрининга семян и выращенных растений в отношении плоидности генома, В-пятых, это существенное уменьшение денежных расходов ввиду полного отказа от использования техники культуры ткани, а следовательно, дорогостоящего оборудования и реактивов. В-шестых, это значительное в 30-50 раэ повышение выхода апомиктных семян в опылениях,Предлагаемый способ при сравнении его с прототипом позволяетдобиться значи-. тельного уменьшения абортивных семян в опылениях при одновременном увеличении числа нормальных семян, которые имеют партеногенетическое происхождение и обладают высокой всхожестью, Выбор в качестве второго компонента пыльцесмеси пыльцы петунии гибридной, доля которой 30 характерно проявление межродовой инконгруиции в комбинации с душистым табаком,а также зиготической несовместимости родительских геномов, позволяет избежать появления в потомстве семян гибридного происхождения, Последнее условие обеспечивает 100 ф выход диплоидных апомиктов душистого табака в растительном потомстве, выращенном в условиях традиционного высевания семян в почву, Способ гарантирует появление диплоидных апомиктов материнского происхождения в семенном потомстве после опыления.Заявляемый способ воспроизводим, не требует от селекционера специального обучения, может использоваться в теплице и в открытом грунте, Применение способа наиболее целесообразно производить опылением пыльцесмесью, состоящей из равных частей гамма-облученной в дозе 1000 Гр при мощности дозы 0,2 Гр/с пыльцой табака душистого и нормальной пыльцы петунии гибридной, поскольку за пределами этого соотношения наблюдается резкое сниже 55 ние эффективности опылений пыльцесмесями с целью получения диплоидных апомиктов, Стоимость полученных заявляемым способом семян понижается более чем в 50раз по сравнению с прототипом,1787385 12 Формула изобретения Способ получения диплоидных апомиктов табака душистого, включающий сбор пыльцы, облучение ее гамма-радиацией в дозе 1000 Гр и опыление пыльцесмесью, содержащей облученную пыльцу и необлуСостав пыльцесмеси по со- Общее коотношению компонентов личество Плодооб- КоличестВсхоВыход Прижесть се- диплоидмян,ных апомиктов в 1 опыле разование, 7 ь отво семян в плоде,облученная , необлучен-. в дозе 1000 Гр ная пыльца пыльца табака- петунии йуш, . гибр опылений числа шт опылений нии 44+16 12 5+3 0,1+0,1 1,4.ф.0,5 1,0 ф 0.4 28 4 ф 3 2+2 0 0 0 5+4 0 Составитель С, АндрейченкоТехред М.Моргентал Корректор Л. Филь Редактор Заказ 537Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат Патент". г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 2 3 4 5 6 7 1;14:1 2:1 1:2 1:4 1:0 0,1 100 48 50 46 41 30 30 ченную пыльцу таксономически близких растений, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью прямого получения диплоидных семян, опыление проводят пыльцесмесью, содержащей облученную пыльцу табака душистого и необлученную пыльцу петунии гибридной в соотношении 1:1. 100 95 98 86 68 96 0