Способ определения положения максимума спектра хемилюминесценции

.д Южа:а ф,гф , Йф ;уП ЕЛЬСТВ ь вно о ре ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТГ 10 ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫГИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ АВТОРСКОМУ СВИ(71) Физико-химический институт АН УССР(56) Н 1 пянинтох В,Л. и др. Хемилюжнесцентвые методы исследования медленных химических процессов. М., Наука, 1966, с 42.Авторское свидетельство СССР У 306403, кл, 6 01 М 21/76, 1970. (54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПСйОЖЕНИЯ МАКСИМУМА СПЕКТРА ХЕМИЛЮИ 1 НЕСЦЕНЦИИ, цри котором на попарно сгруппированные фотоприемники подают исследуемый световой поток и сравнивают полученИзобретение относится к областиспектрофотометрии, преимущественнок способам измерения спектральных характеристик предельно слабых световых потоков, таких как, например,спонтанная хемилюминесценция биологических объектов,Известен способ определения спектров слабых свечений с помощью набора светофильтров, при котором путемпоследовательной смены одностороннихсветофильтров спектры свечения определяют по разностям сигналов соседних измерений.Недостаток способа заключается втом, что световой поток пропускаютчерез светофильтры, ослаблякщие, егов 50-100 раз, Это не позволяет проводить исследования многочисленныхбиологических объектов, имеющих п ные сигналы, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью расширения диапазона определения в область сверхслабыхсвечений, на фотоприемники, спектрапные характеристики которых выбраныпопарно перекрещивающимися, сначйтаподают эталонные монохроматическиесветовые потоки и, изменяя чувствительность фотоприемников, попарноуравнивают их сигналы, а в момент равенства сигналов фиксируют чувствительность фотоприемников, после чегопрекращают подачу эталонных световых потоков и подают исследуемый световой поток, и по соотношению полученных при этом сигналов определяютположение максимума спектра хемилк"мине сценции. дельно слабую интенси сть хемилюминесценции.Кроме того, нахождение положения максимума спектра по этому способу возможно после определения всего спектра,что обусловливает наряду с получением избыточной информации его значительную трудоемкость.Наиболее близким по своей сущнос ти является способ определения подо жения максимума спектра хемилюминесценции, при котором на попарнб сгруппированные фотоприемники подают исследуемый световой поток и сравни ют полученные сигналы, а положение максимума спектра определяют по поля ности знаков разности сигналов с фот приемников, полученных через светофильтры, пропускающие волны длин, расположенных но обе стороны от заданных граничных длин, что по сравнению с аналогом упрощает и ускоряет измерения.Однако этот способ непригоден для предельно слабых свечений, имеющих место например, при спонтанной хемилюминес-, ценцйи биологических объектов, что сужает диапазон определений положения максимума спектра. ОКроме того, реализуемая указанным способом точность определяется количеством дискретных участков, на которые разбит весь спектральный диапазон. Поэтому достижение высокой точности требует большего числа дискретных участков и, следовательно, значительного объема оборудованияЦель изобретения " расширение диа"., пазона определения в обпасть сверхсла- - 20 бых свечений.Это достигается тем, что на фотоприемники, спектральные.характеристи-. ки которых выбраны попарно перекрещи,вающимися, сначала подают эталонные монохроматические световые потоки и, изменяя чувствительность фотоприемников, попарно уравнивают их сигналы, а в момент равенства фокусируют чувствительность фотоприемников, после чего прекращают подачу эталонных потоков и подают исследуемий световой поток и по соотношению полученных при. этом сигнапов определяют положение максимума спектра хемилюминесценции.Выбор спектральных характеристик35попарно перекрещивающимися обеспечивает получение общих для, каждой пары "фотоприемниковточек с одинаковой чувствитепьностью, которые образуются в месте пересечения спектрапьных характеристик. При подаче на эти фотоприемники светового потока, максимум спектра которого совпадает с длиной волны пересечения спектральных 45 характеристик, наблндается равенство сигналов, что позволяет придать каждой паре фотоприемников свойство селективности, которым каждый из них в отдельности не обладает. Изменение чувствительности фотоприемников обеспечивает изменение положения точки пересечения их спектрапь" ных характеристик прн различных длинах волн. 55Попарное уравнивание сигналов позволяет задать точку пересечения спек- трапьных характеристик пар фотоприемников при длинах волн эталонных световых потоков.Фиксирование чувствительности обеспечивает постоянство заданных точек пересечения пар фотоприемников н позволяет использовать длины волн эталонных световых потоков в качестве исходных для подсчета положения максимума спектра,Прекращение подачи эталонных световых потоков и подача исследуемого светового пбтока позволяют провести сравнение длин волн световых потоковс положением максимума спектра исследуемого светового потока.Определение соотношения сигнапов позволяет установить степень различия между длинами волн эталонных световых потоков и положением максимумаспектра исследуемого потока и поней определить положение максимумаспектра.При определении положения максимума спектра не происходит ослабленияэнергии исследуемого светового потока, в результате становится возможным проводить определение в более шнроком диапазоне интенсивностей световых потоков, включающем предельно слабые световые потоки.На фиг. 1 дана функциональная схе" ма устройства, реализующего способ;на фиг, 2 дано графическое пояснениек определению положения максимума спектра хемилюминесценции по предлагаемому способу (осуществление способаусловно показано на примере одной пары фотоприемников),Способ реализуется на основе известных узлов устройством, содержащим по крайней мере два фотоприемника 1 и 2, подключенных к измерителям сигналови 4. Устройство содержиттакже блок питания 5 и 6, подсоединенные к соответствунщим фотоприемникам 1 и 2 через регуляторы напряжения питания 7, 8. Количество пар фотоприемников 2 и 1 определяется числом диапазонов длин волн, котороевыбирается нз условий конкретной эадачи. Например, дпя работы в областидлин волн 480-800 нм достаточноиспользовать одну пару фотоумножителей со спектральными характеристиками С 1 и С 11. Спектральные характеристики пары фотоприемников 1 и 2 взаимно перекрещиваются. При этом положение .точки пересечения спектральных15 10821характеристик зависит от чувствительности фотоприемников, которая в свою.очередь определяется режимом эксплуатации, например напряжением питания.Определение положения ма симума 5спектра хемилюминесценции производятв следующей поспедовательности.Включают питание фотоприемников 1,2 и всей измеритепьной схемы, а затем на фотоприемникии 2 подают эталонный световой поток с известной длиной волны монохроматического излуче ния А . При этом в случае использования нескольких пар фотоприемников накаждуюиэ них подают эталонные световые потоки с длиной волны, расположенной в интервале перекрещиванияспектральных характеристик соответст. -вующей пары фотоприемников, 20Затем сравнивают. показания измерителей сигналов 3 и 4 между собой.Различие показаний свидетельствует отом, что сигналы фотоприемникови2 не равны, Это обусловлено различной 25их чувствительностью к свету с длинойволны Ъо. Например, если спектраньнаяхарактеристика фотоприемниказанима.ет положение 9, а фотоприемника 2 -положение 10, точка их пересечения Ане совпадает с длиной волны 3, врезультате чего фотоприемникии 2имеют различную чувствительность приэтой длине волны,Изменяют чувствительность фотоприемников 1 и 2 в направлении уравнивания сигнапов. Для этого при помощирегуляторов:7, 8 изменяют напряжениепитания. фотоприемников 1 и 2 такимобразом, чтобы показания измерителейсигналов 3 и 4 приближапись друг кдругу еУравнивают сигналы, для чего устанавливают при помощи регуляторов 7, 8напряжение питания фотоприемников 1и 2 таким образом, чтобы показанияизмерителей сигнапов 3 и 4 были равны между собой.В момент равенства сигнапов фикСи-.Руют чувствительность фотоприемников1, 2, для чего стопорят ручки управления регуляторов напряжения питания7.и 8. При этом чувствительность фо-.топриемника 1 и 2 для Я будет одинаковой, что обусловлено совмещениемточки пересечения из спектральныххарактеристик с этой длиной волны,Например, при уравнивании сигналовположение спектральной характеристи 16 6ки фотоприемника 2 изменилось с позиции О и 11, а положение спектральнойхарактеристики 9 фотоприемника 1 осталось неизменным. Новое положение 9и 11 спектральных характеристик дает (точку их пересечения В, совпадающуюс длинои волны Яэ,После фиксирования чувствительности прекращают подачу эталонного светового потока и подают исследуемый световой поток.Затем определяют соотношение сиг"налов от фотоприемников 1 и 2, длячего показания измерителей сигналов3 и 4 делят одно на другое. Величинасоотношения сигналов указывает на каком расстоянии и с какой стороны расположен максимум спектра от точки пересечения спектрапьных характеристикфотоприемников 1 и 2, зафиксированнойпри Я. Поскольку длина волны эталонного светового потокаизвестна, тополученное соотношение позволяет однозначно оаределить (например, поградуировочному графику) положениемаксимума спектра.Например, при соотношении сигналов2/1 соотношение получено делениемпоказаний измерителя сигналов 4 напоказания измерителя сигналов 3) максимум спектра расположен при длиневолны ф +Ь а при соотношении 1/3-при длине волны фз -Ь, где 1,и 5 врасстояния от точки В пересеченияспектральных характеристик фотоприемниковЕсли ниспадающие и восходящие ветви спектрапьных характеристик не являются прямыми линиями, то переходот соотношения измеряемых сигналов кположению длины волны осуществпяют поградуировочной кривой, для построениякоторой поступают следующим образом,На градуируемую пару фотоприемников подают эталонный световой потоки, изменяя чувствительность, уравнивают их сигналы, В момент равенствасигналов фиксируют чувствительностьфотоприемников, после чего,прекращают подачу эталонного .светового потока вместо .исследуемого и подают градуирующий,монохроматический световой поток, длину воиныкоторого мож-но задавать, например, при помощимонохроматора. Измеряют сигналы фотоприемников и определяют их соотношение. Далее изменяют длину волны све-тового потока и для каждой задаваемойданны волны .определяют новые соотношения сигналов фотоприемников, По полученным данным строят градуировочнуюкривую. Аналогичным образом строятградуировочные кривые для других пар.5Фотоприемников, Полученные кривыепригодны для использования только стем этапонным источником, которыйбыл использован для градуировкиф 10Располагая градуировочными кривыми, не трудно по соотношению сигналов определить положение длины волны .исследуемого светового потока.Ниже приводим конкретные примеры,подтверждающие положительный эффектпредлагаемого способа,П р и м е р 1, Определяют положение максимума спектра хемилюминесценции, возникающее при взаимодействиилюминола с перекисью водорода в диме-.тилсульфоксиде.Для этого в качестве фотоприемников берут две пары фотоумножителей,первая из которых состоит иэ фотоумножителей со спектральными характеристиками 012 и С 10, перекрещнвающимисяв области 240-420 нм, а вторая парасостоит из фотоумножителей со спек. тральными характеристиками С 12 и С 1,10перекрещивающимися в области длинволн 420-800 нм.Перед определением каждую паруфотоумножителей градуируют при помощи монохроматора и эталонных источников света. Для пары фотоумножителей35со спектральными характеристиками0 12, 0 10 используют этапонный источник с длиной волны 290 нм, а дляпары с характеристиками С 12, С 1эталонный источник с длиной волны560 нм. Данные градуировки отражаютв виде графиков, построенных в координатах: "соотношение сигналов фотоумножителей - длина волны максимумаспектра". Для определения положения максимума спектра сначала на фотоумножители подают два эталонных световых потока с длинами волн 290 и 5 бО нм. Изменяя50 чувствительность Фотоумножителей путем изменения напряжения питания, попарно уравнивают их чувствительность.В момент равенства сигналов чувствительность фиксируют, Затем прекращают подачу эталонных световых потоков и подают световой поток от исследуемого образца. Измеряют сигналы фотоумножителейи определяют соотношение между сигнанапами в обеих парах фотоумножителей,Из полученного соотношения по градуировочной кривой определяют положениемаксимума спектра.Поскольку сигнал Фотоумножителя схарактеристикой 0 10 равен нулю, тодпя определения положения максимумаспектра используют соот.ношение сигналов от фотоумножителей со спектральными характеристиками С 12 и 0 1Параплельно проводят определениеизвестным способом (прототип), Данные сведены в таблицу.П р и м е р 2. Определяют положение максимума спектра хемнлюминесценции, возникающие при взаимодействии люминола с перекисью водородав диметилсульфоксиде.Дпя жтого в качестве Фотоприемников берут две пары Фотоумножителей соспектральными характеристиками С 12,С 10, и СК, С 1. Обе пары Фотоумножителей предварительно градуируют.Для определения положения максимума спектра сначала на фотоумножителиподают два эталонных световых потокас длинами волн 290 и 560 нм, Изменяячувствительность Фотоумножителей, попарно уравнивают их чувствительностьи в момент равенства сигналов чуствительность фиксируют. Затем прекращают подачу эталонных световых потокови подают световой поток от исследуемо"го образца, который предварительноослабляют при помощи нейтрапьных светофильтров в 150 раэ.Изменяют сигналы Фотоумножителейи определяют соотношение межцу сигналами в обеих парах фотоумножителей,Из полученного соотношения сигнаповфотоумножителей с характеристиками012 и С 1 по градуировочной кривой определяют положение максимума спектра.Параллельно проводят определениеизвестным способом (прототип). Приэтом световой поток от исследуемогообразца также ослабляют в 150 раз припомощи нейтральных светофильтров.Данные сведены в таблицу,П р и м е р 3, Определяют положение максимума спектра хемилюминесценции тканей ягоды культурного винограда Ч 11 з Япйега 1Для этого берут две пары фотоумножителей со спектрапьными характеристиками С 12, С 10 и С 12, 01. Обе пары16юПример 2 Пример 3 Пример. 1 ПредлагаемыйспособСпектральнаяхар актеристи"ка фотоумножителей С С 2 С 10 С 12 С 1 С 12 С 10 С 12 С, С 12 С 10 012 Сигналы фотоприемников,мв 960 2010 0 860 36 79 О 32 0 436 52 .873 Соотношениесигналов 048 48 - . 046Положение максимума спектра нм 495 492 0,06 360 Положениемаксимума поизвестномуспособу (прототипу) впределах, нм не определяется не определяется т477-502 90821 Фотоумножителей предварительно градуируют фДля определения положения максимума спектра сначала на Фотоумножители подают два эталонных световых потока с длинами волн 290 н 560 нм. Изменяя чувствительность Фотоумножителей, попарно уравнивают их чувствительность, а в момент равенства сигналов чустви"О тельность фиксируют. Затем прекраща" ют подачу эталонных световых потоков и подают световой поток от исследуемого образца тканей ягоды, Измеряют сигналы фотоумножителей и определяют .соотношение между сигналамн, Из полученного соотношения по градуировочной .кривой фотоумножителей со.спектральными характеристиками С 10 и С 12 оп" ределяют положение максимума спектра. Вторая пара фотоумножителей в опре"20 делении не используется, так как сигнал от фотоумножителя с хараятеристи-. кой С 1 равен О. Параллельно проводят определение известным способом (прототип), Дан-. ные сведены в таблицу.Изобретение выгодно отличается от известных способов определения положения максимума спектра тем, что рас. ширяет диапазон определения. Это дос. тигается за счет исключения потерь светового потока, благодаря чему впервые открывается воэможность определять положение максимума спектра предельно слабых световых потоков, так как известные способы не позволяют решать эту задачу. Как показали испытания, предложенный способ позво-. ляет осуществлять определения для световых потоков с интенсивностью, превышающей лишь в 3-4 раза шума каж" дого иэ. Фотоприемников.Применение способа на практике поз-. воляет повысить эффективность хеиилюминесценции исследований биологических объектов.