Способ определения катехоламинов в биологической жидкости

Союз Советскик Социалистическик Республик(22) Заявлено 090278 (21) 2580122/23-04с присоединением заявки Ио(51)М. Кл.3 С 01 К 33/50 Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытий(72) Авторы изобретения П,М.Аширов, Г,И.Лихтенштейн и С.П.Смоттровг Таджикский государственный университет иМ. В.И.Ленина,(71) Заявитель(5 ч) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАТЕХОЛАМИНОВ В БИОЛОГИЧЕСКОЙЖИДКОСТИ 0 з Сн 3Соон Онс - с11 и -НС - СО СН сн "з с "з - -О / нзс Ф снз сн 3 Изобретение относится к анализу биологических объектов, преимущественно в диагностических и прогности ческих целях,Известен способ определения катехоламинов в биологической жидкости, заключающийся в том, что к пробе биологической жидкости одновременно добавляют антисыворотку к определенному катехоламину и меченый катехол-: амин,инкубируют полученную смесь при 0-5 С в течение 18 ч, отделяют несвязавшийся меченый катехоламин с последующим определением радиоактивности связавшегося с антисывороткой меченого катехоламина Г 11Недостатком известного способа является его длительность.Цель изобретения - сокращение времени проведения анализа.Указанная цель достигается тем, антисыворотку к определяемому катехоламину и меченый катехоламин предварительно смешивают, полученную смесь инкубируют и после добавления к ней пробы биологической жидкости смесь повторно инкубируют и снимают спектр электронного парамагнитного ,резонанса, причем в качестве меченого катехоламина используют катехоламин общей формулый - М,где и " катехоламин, соответствующий 5 определяемому,ок М Нзс снз )О НС и Сн При предварительном смешивании 25 антисыворотки и катехоламина с ковалентно присоединенным к нему свободно-радикальным соединением происходит полное связывание антисыворотки с меченым катехоламином. По 3 О лученную смесь инкубируют в течение40 60 1 ч для полного взаимодействия ком 1понентов и затем добавляют к нейпробу вещества. Полученный составповторно инкубируют в течение 30 минпри этом происходит конкурентноевытеснение определяемым катехоламином биологической жидкости эквивалентного количества меченого катехоламина, связанного с антисывороткой,Вытесненный с поверхности молекулопределенного класса белков (антисыворотки) меченый катехоламин, количество которого эквивалентно определяемому в биологической жидкости,подвергают, не отделяя от состава,спектральному анализу и по спектруЭПР определяют количество катехоламина в пробе вещества,Приготовление специфических к катехоламину антител.Получают конъюгат бычьего сывороточного альбумина (БСА) с норадреналином (НА) с помощью конъюгирующего реагента водорастворимого карбодиимида (ВКД). 1 г БСА растворяютв 10 мл дистиллированной воды. Враствор добавляют 1 г НА. К полученному раствору приливают 0,5 г метапара-толуолсульфонат-циклогексил 3(2-морфолинил-этил)карбодиимида,растворенного в 5 мл воды. Смесьтщательно перемешивают и инкубируютпри комнатной температуре сутки. Затем проводят диалиэ в течение 3 сутпротив дистиллированнойводы. 0,75 гполученного конъюгата растворяют в30 мл .дистиллированной воды и добавляют 0,125 г фенола, 0,225 гйаС 1 и 75 мл геля А 1(ОН), 2,5 млэтой смеси вводят внутримышечно животным в два места раэ в неделю втечение шести недель. Через неделюпосле последней инъекции у кроликаберут кровь. Наличие антител к гаптену в антисыворотке определяют иммунодиффузией в агаре по методу Сухтерлони.Получение спин-меченого норад 45реналина,3,6 мг НА растворяют в 1 мл 0,05 Е.боратноГо буфера рН 9,0. В растворвносят 17 мг иминоксильного радикала.Смесь перемешивают б ч при комнатнойтемпературе, затем добавляют 1 мгиатрийборгидрида и смесь перемешивают еще 2 ч. Раствор нейтрализуют0,1 н. раствором НС 1 и освобождаютот непрореагированного радикала гельфифтрацией через колонку с сефадексом С, используя в качестве элюирующего раствора бидистиллированнуюводу, Степень очистки контролируютспектрофотометрически, методом ЭПРи с помощью тонкослойной хроматографии.Получение спин-меченого комплекса гаптен-антитело.Б тонкостенную стеклянную ампулувносят 10 мкл -глобулиновой фрак ции сыворотки иммунизированного кролика и 10 мкл раствора спин-меченс го . норадреналина, содержащего 10 б моль/л иминоксильного радикала, смешивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч. Контроль за полнотой взаимодействия гаптенантитело проводят на ЭПР-спектрометре,Построение калибровочной кривойГрадуировку производят по спин- меченому комплексу гаптен-антитело, содержащему известную концентрацию норадреналина. В 4 ампулы, содержащие по 20 мл раствора спин-меченого комплекса, добавляют по 30 мкл стандартного раствора норадреналина следующих концентраций: 0,1 мкг/мп, 0,5 мкг/мл, 1,0 мкг/мл, 2,0 мкг/мл. Растворы перемешивают и инкубируют в течение 30 мин, При последующем измерении на ЭПР-спектрометре снимают характеристики полученных спектров. Строят калибровочную кривую зависимости амплитуды полученного сигнала от концентрации норадреналина в стандартных растворах.П р и м е р 1. Количественное определение норадреналина в моче.Пробу суточной мочи здорового человека концентрируют до объема 1 мл, В тонкостенную стеклянную ампулу вносят 10 мкл антисыворотки к норадреналину и 10 глкл меченого норадреналина (10 И) с общей структурной формулойноСН - СН - ЮН,а.Х;"0Полученную смесь инкубируют в термостате при 37 ОС в течение 1 ч. Контроль за полнотой взаимодействия . компонентов проводят на ЭПР-спектрометре. После инкубации к смеси добавляют 30 мкл пробы концентрированной мочи и полученный состав повторно инкубируют в термостате при 25 оС в течение 30 мин. Затем ампулу, содержащую вышеуказанный состав, помещают в резонатор ЭПР-спектрометра и снимают спектр, Измеряют характеристики спектра и определяют количественное содержание нерадреналина, используя при этом калибровочный график зависимости количественных характеристик спектра (отношение амплитуды второй компоненты спектра меченого норадреналина к амплитуде эталона - Мпф 1 ) от количественного содержания норадреналина в стандартных растворах. Содержание норадреналина в 1 мл концентрированной мочи испытуемого здорового человека, определенное предлагаемым способом, составляет 24,4 мкг.Результаты количественного определения других катехоламинов в моче здорового человека, полученные предлагаемым способом, приведены в таблица,Определение нужного катехоламина в в биологической жидкости предлагаемыспособом занимает всего 1,5 ч, чтозначительно мвиыае времени определения известным способом (18 ч идополнительная операция пб отделению избытка меченого катехоламинаиз состава).ох О 6 о о О %-1 1 1 32 оо Еае роо о Ва10 789752 Формула изобретения сиз Сн соон Снснэ ца-О) о Ф И М нс с Составитель С.Хованская елактор И,Михеева Техред М.Кузьма Корректор М Демчи025/38 Тираж 1019 ВНИИПИ Государственног по делам изобретени 113035,Москва,Ж,Раушака Подписное комитета СССР и открытий ая наб.,д.4/5Филиал ППП "Патент",г.ужгород,ул.Проектная,4 Способ определения катехоламиновв биологической жидкости, путем добавления к пробе биологической жид.кости антисыворотки к определяемому катехоламину и меченого катехоламина, инкубирования полученнойсмеси, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью сокращения временианализа, антисыворотку к определяемому катехоламину и меченый катехоламин предварительно смешивают,полученную смесь инкубируют и последобавления к ней пробы биологической жидкости смесь повторно инкубиру-.ют и снимают спектр электронного 15парамагнитного резонанса, причем вкачестве меченого катехоламина используют катехоламин общей формулыК - М,где й - катехоламин, соответствующий определяемому,03. 0Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1, С гойа О., й.оып О, Ап 1 1 Ьобеао СайесЬоащпеь,-пЕпбосгпооцуп976, 98,3,с,615,622 (прототип).