Способ получения ферментов
Похожие патенты | МПК / Метки | Текст | Заявка | Код ссылки
Текст
щих по принципу аппарата полного вытеснения, в которых создают однонаправленный ламннарный поток (К ( 2300)свежей питательной среды по поверхности фиксированного слоя мицелия. Приэтом с выхода одного или несколькихпоследующих сосудов отбирают частькультуральной жидкости, обогащают еекислородом и вводят в предыдущие сосуды.По мере направленного перемещения культуральной жидкости относительно мицелия продуцента она обедняется питательными веществами и обо,гащается продуктами метаболизма и углекислым газом;Тем самым в каждом последующем сосуде создаются условия, отличающиесяот предыдущего в обуславливающие оп,ределенную физиологическую активностькультуры и характер синтезируемых еюбиополимеров.Таким образом, повторное заведение части культуральной жидкости изпоследующего сосуда в предыдущий позволяет получить в последующем сосуде увеличенную концентрацию целевогометаболита, тем самым дополнительноиндуцируя его биосинтез в предыдущем сосуде, что приводит к повышениювыхода целевого продукта.Такой обратный. переток части культуральной жидкости может быть организован как между соседними (смежными) сосудами, так и через один илинесколько сосудов. Этот рецикл частикультуральной жидкости делает весьпроцесс культивирования ступенчатоуправляемым, а поддержание скоростикаждого из таких рециклов (в каждойпаре сосудов) на определенном уровие в сумме с постоянным основным протоком культуральной жидкости черезвсе сосуды обеспечивает стабильность каждого из состояний мицелияпродуцента,Способ осуществляют следующим образом,Последовательно соединенные сосуды 1-5 с развитой внутренней поверхностью заполняют стерильной питательной средой до полного заполнения их геометрического объема,термостатируют, вносят инокулюми обеспечивают рециркуляцию жидкойфазы по направлению от 1 к 5.в течение 30-40 мин для гомогенного распределения инокулюма, Затем рецир 55 Сосуды заполняют питательной средой указанного состава, термостати руют при 30 С; вносят инокулюм иовключают рецнрк уляцию культуральной среды на 30 мин в направлении от 1 к 4 сосуду, затем ведут процесс пекуляцию отключают, включают аэрациювоздухом, обогащенным кислородом до30-4 ОЕ от объема, со скоростью50,4-0,6 л воздуха/л среды/мин и ведут культивирование периодическим .способом в течение 16-72 ч в зависимости от используемого штамма-продуцента.После перехода культуры в фазу замедления роста на вход первого культивиционного сосуда подают свежую питательную среду со скоростью разбавления Р в диапазоне 0,01-0,2 ч- и,.последовательно вытесняют ее и предшествовавшую ей культуральную жидкость иэ сосуда в сосуд в направлении от 1 к 5, В случае необходимости последовательно соединенныесосуды термостатируют при разных температурах и дополнительно обогащаютимпульсным введением кислорода в жид-.:кую фазу на уровне от 2 до 5 сосудов,Кроме того, часть культуральнойжидкости иэ сосуда 3 (или 4 нли 5)после обогащения кислородом возвращают, например, в сосуд 2 (или 3,или 4), осуществляя частичную рециркуляцию культуральной жидкостипо замкнутому контуру,Съем целевого продукта осуществляют, например, иэ одного из этих сосудов в фазах его максимального выхода.П р и м е р 1, КультУРУ дрожжей1 Епйошусорз 1 з Е 1 Ьц 11 яег 5513 в качестве продуцента амилолитических ферментов выращивали в жидкой питательнойсреде. следующего состава, 7: крах 40мал, кукурузный 1, О; КНРОО, 5;кукурузный экстракт 1,О.Культивирование продуцента ведутв установке, состоящей из сосудов1-4, последовательно соединенных попринципу аппарата полного вытеснения,Аэрацию осуществляют продувкой воз-духа, обогащенного кислородом, израсчета 0,5 л/л/мин. Поддержание рНобеспечивают автоматической подтит 50ровкой 0,5 ИаОН и стабилизируют в сосудах 1 и 2 на уровне 5,5-5,6,.а всосудах 3 и 4 на уровне 4,5-5,0,15 155536 1 О 15 20 25 ЗО 35 40 45 50 В результате активность ингибитора составляет в сосуде 1 3 едв сосуде 2 6 ед, в сосуде 3 12 ед,П р и м е р 7, Повторяют всемвтодики и режимы примера 4 с тем .лишь отличием, что сосуд 3 термостатируют при 28 С,55 риодического культивирования в тече ние 72 ч.После этого на вход сосуда 1 подавали свежую питательную среду с 0 = 0,1 ч и постепенно вытесняют ее в последующие сосуды, Из сосуда 4 отработанную культуральную жидкость, обогащенную чистым кислородом, подают в сосуд 3 с В=0,02 ч-, В культу- ральной жидкости, отбиравшейся иэ всех четырех фаз культивирования, определяют активность глюкоамилазы и а(-амилазы,Глюкоамилазная активность достигает максимума в сосуде 2 установкии составляет 46 мкмоль/мл, что в 4раза выше, чем при периодическомкультивировании, и в 3,8 раза выше,чем при двухстадийном культивировании в ферментерах идеального смешения,Активность Ы-амилазы достигает максимума в сосуде 4 установки и составляет 3,4 ед/мл, что в 7 раз выше, чем при периодическом культивировании в 12 раз выше, чем при двухстадийном культивировании в ферментерах идеального смешения.П р и м е р 2. Все операции как в примере 1, но отбор культуральной жидкости из сосуда 4 и подача ее в сосуд 3 отсутствуют,. Аналогично примеру 1 определяют активность глюкоамилазы и Ы-амилазы. Максимум глюкоамилазной активности наблюдается в сосуде 2, а максимум активности Ы-амилазы в - сосуде 4. Однако числовые величины этих активностей снижаются по сравнению с примером 1: глюкоамилазы - в 2,2 раза (20,9 мкмоль/мл), о-амилазы - в 1,8 раза (1,88 ед/мл).П р и м е р 3. Все операции как в примере 1, с тем отличием, что отбор культуральной жидкости из сосуда 4 и подачу ее в сосуд 3 осуществляют с Р=0,08 ч- . Максимум глюко- амилазной активности наблюдается в сосуде 2, а максимум активности Ы-амилазы в сосуде 4, Однако числовые величины этих активностей снижаются по сравнению с примером 1: глюкоамилазы - в 2,4 раза (19,16 мкмоль/мл) о 1-амилазы - в 3,1 раза (1,09 ед/мл).П р и м е р 4. Культуру актиномицетов АсЯпошусеэ 1 апдпив 118 в качестве продуцента ингибитора трипсина выращивают на жидкой питательной среде следующего составамас,7.: пелтон 5,0; перевар Хоттингера 30 мл; 2 бглюкоза 10,0; БаС 1 5,0. Стабилизируют рН среды подтитровкой 0,5 н, БаОН в зоне 6,8-7,0, культивирование осуществляют в установке, представ" ляющей три последовательно соединен" ных сосуда полнбго вытеснения с развитой внутренней поверхностью,Установку заполняют питательной средой укаэанного состава, термостатируют при 28 С, вносят инокулюм ивключают рециркуляцию питательной среды на 30 мин по замкнутому контуру, Периодическое культивирование, осуществляют в течение 40 ч, а за- тем в сосуд 1 подают свежую питательную среду с П=0,12 ч- и вытесняют жидкую фазу потоком в последующие сосуды, При этом сосуды 1 и 2 термосстатируют при 28 С, а сосуд 3 - при 34 С.Культуральную жидкость из сосуда 3 насыщают кислородом и с 0=0,03 ч дополнительно вводят в сосуд 2 установки.В культуральной жидкости, отбиравшейся из каждого сосуда, определяют антитрипсиновую активность по изменению эстеразной активности трипсина, используя в качестве субстрата тозил-Е-аргининметиловый спирт,В сосуде 1 активность ингибито ра составляет 3 ед, в сосуде 2 8 ед. н в сосуде 3 18 ед, что в 4 рава вы" ше, чем максимальная активность, достигаемая при периодическом культивировании. П р и м е р 5. Методики и режимы те же, что и в примере 4 с тем лишь отличием, что отбор культуральной жидкости из сосуда 3 и подачу ее в сосуд 2 осуществляют с Р=0,02 ч ,В результате активность ингибитора составляет в сосуде 1 3 ед, в сосуде 2 5 ед, в сосуде 3 14 ед,П р и м е р 6. Повторяют все методики и режимы примера 4 с тем ф лишь отличием, что отбор культуральной жидкости из сосуда 3 и подачу ее в сосуд 2 осуществляют с Рщ 0,05 ч .15553 б 2В результате активность ингибитора составляет в сосуде 1 3 ед, в сосуде 2 8 ед, в сосуде 3 10 ед,П р и м е р 8. Культуру актиномицета Асйпошусез Кпгззапоч 1 75 вкачестве продуцента хитинолитических ферментов выращивают на жидкойпитательной среде следующего состава,г/л: Е НРО 4 3,0; МАЛО 7 НО 0,5; дрож жевой экстракт 0,5, размолотый хитин (частицы 250 меш) 10,0,Культивирование продуцента ведутв установке, состоящей из 4-после,довательно соединенных сосудов полного вытеснения с развитой внутренней поверхностью.Сосуды заполняют питательной средой указанного состава, термостатируют при 30 Свносят инокулюм и на,30 мин выключают рециркуляцию средыпо замкнутому контуру. Затем в течение 16 ч осуществляют периодическоекультивирование гриба с азрацией от1-го к 4-му сосуду. Затем в сосуд 251 подают. свежую питательную среду сП 0,15 чи постепенно вытесняютее внаправлении сосуда 4. Часть культуральной жидкости с выхода сосуда 4обогащают кислородом и с 0=0,05 ч30подают в сосуд 2 а термостатиро"вание сосуда 3 осуществляют при 34 Си в него дополнительно подают воздух, обогащенный кислородом до 40 со скоростью 0,1 л/л/мин,В культуральной жидкости, отбиравшейся из каждого сосуда, определяютактивность хитиназы (СН,-Фермент)и активность СН -Фермента, расщепляющего коллоидный хитин, а также 40активность фермента, расщепляющегоЯ-Я-диацетилхитобиозу и другие короткие олигосахариды хитинового ряда,Активность хитиназы (СН-Фермент)достигает максимума в сосуде 2 и составляет 22 ед или 2,2 раза выше,чем при периодическом культивировании, а затем снижается.Максимум активности ( Н фермента 5 Одостигается в сосуде 3 и составляет32 ед или в 4 раза вышее, чем припериодическом культивировании, а максимальная активность фермента, расщепляющего короткие олигосахаридыхитинового ряда, повышается в сосуде 4 и в 2,8 раза превосходит обнаруженную при периодическом культивировании,П р и и е р 9, Повторяют все методики и режимы примера 8 с тем лишьотличием, что отбираемую из сосуда4 и подаваемую в сосуд 2 культуральную жидкость не обогащают кислородом,В результате максимум активностихитиназы (СН -фермент)наблюдается всосуде 2 и составляет 12 ед, что в1,8 раза ниже, чем в примере 8, максимум активности СН -Фермента наблюдается в сосуде 3 и составляет 15 ед,что в 2,1 раза ниже, чем в примере8, максимум активности фермента,расщепляющего короткие олигосахаридыхитинового ряда, вновь наблюдается всосуде 4, однако он в 1,5 раза ниже, чем в примере 8.П р и м е р 10. Повторяют все методики и режимы примера 8 с тем лишьотличием, что термостатирование сосуда 3 осуществляют при 38 С.В результате все виды проверяемых активностей в сосудах, за исключением первого, снизилась ориентировочно в 4-5 раз по сравнению с примером 8,Предлагаемый способ позволяет управлять биосинтезом ферментов на каждой фазе роста продуцента, разделитьвыход целевых продуктов по отдельным стадиям и повысить их выход в несколько раз по сравнению с известными способами при периодическом идвухстадийном батарейном культивировании мицелиальных форм микроорганизмовформула из обре тенияСпособ получения ферментов, предусматривающий многофазовое культивирование мицелиальных форм микроорганизмов на жидких питательных средах путем фиксации продуцентов на внутренних поверхностях ферментера и перемещения относительно них жидкой и газообразной Фаз питательной среды с последующей стабилизацией культур в заданном физиологическом состоянии и оптимизацией параметров условий биосинтеза ферментов до максимального накопления их активности, отличающийся тем,что, с целью повышения продуктивности культур за счет одновременного выхода нескольких целевых продуктов, синтезируемыхпродупентами в разных фазах роста, культивирование ведут538 Тираж 487 ПодписноеГосударственного комитета по изобретениям и открытия113035, Москва, Ж 35, Раушская наб., д. 4/5 ЗакаВНИИПИ и ГКНТ СССР Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 одновременно в нескольких последовательно соединенных сосудах, работаю- щих пб принципу аппаратов полного вытеснения в условиях однонаправФ5 ленного ламинарного потока свежей питательной среды, при этом на выходе каждого иэ сосудов отбирают часть культуральной жидкости, равной по2 ообъему подаваемой свежей .питатеЛьной.среды, аэрируют ее и вновь подают всосуд с последующим отбором и выделе;нием целевых продуктов в стадии ихмаксимального образования, прйчем вкаждом иэ сосудов поддерживают параметры, оптимальные для биосинтеэа соответствующих ферментов,
СмотретьЗаявка
4375862, 08.02.1988
СПЕЦИАЛЬНОЕ КОНСТРУКТОРСКОЕ БЮРО БИОЛОГИЧЕСКОГО ПРИБОРОСТРОЕНИЯ АН СССР, ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ, ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ БИОТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ
НЕСТЕРОВ БОРИС ФЕДОРОВИЧ, ШКИДЧЕНКО АЛЕКСАНДР НИКОЛАЕВИЧ, ВЕЛИЧКО БОРИС АФАНАСЬЕВИЧ
МПК / Метки
Метки: ферментов
Опубликовано: 07.04.1990
Код ссылки
<a href="https://patents.su/5-1555362-sposob-polucheniya-fermentov.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Способ получения ферментов</a>