Проточный цитофлуориметр-сортировщик клеток

СООЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК А 51) 4 С 01 й 21/64 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(71) Ленинградский институт ядернойфизики им. Б.П,Константинова и Институт цитологии АН СССР(57) Изобретение относится к области технической физики, а именно,к аналитической микрофлуориметрии,Целью изобретения является увеличение чувствительности и точности измерений флуоресценции проточнымцитометром-сортировщиком клеток.Устройство состоит из узла эпивозбуждения и сбора флуоресценции, Проточная камера снабжена гидродинамической фокусировкой суспензии клеток.Вход проточной камеры выполнен ввиде капилляра. Узел эпивозбужденияи сбора флуоресценции содержит высокотемпературный иммерсионный объектив, Ось капилляра расположена вполе зрения микрообъектива. 3 ил.1267231 40 Изобретение относится к технической Йизике, а именно к аналитической микрофлуориметрии, в частности к приборам для биологии и медицины, и наиболее эффективно может 5быть использовано Для скОростногоанализа флуоресценции и автоматической сортировки клеток и клеточныхОрганелл, отличающихся по флуоресцентным характеристикам.1 ОЦель изобретения - увеличениечувствительности и точности измерений флуоресценции проточным цитофлуориметром-сортировщиком клеток,На фиг, 1 представлена схема про" 15точного цитофгГуориметра-сортировщика клеток, содержащая источник света 1, коллектор 2, светофильтр 3 длявыделения света возбуждения, светоделительную интерференционную пла 20стинку 4, иммерсионный микрообъектив5 (1, 2, 4, 5. - узлы эпи-возбужденияи сбора флуоресценции) проточнуюкамеру 6 с гидродинамической фокусировкой, капилляр 7, светофильтр 8для выделения света Йлуоресценции,фотоэлектронный умножитель 9 для выделения света флуоресценции, Йотоэлектронный умножитель 9 (,ФЭУ), систему анализа и управления сортиров 30кой кцеток 10, пьезоэлектрическийпреобразователь 11, систему сбораи разделения клеток, содержащую отклоняющие пластины 12, резервуар 13сбора клеток. 35На фиг. 2 представлены результатыанализа суспензии лимфоцитов мыши,окрашенных ДНК специфичным флуоресцентным красителем,Пик В получен при анализе суспензии в стеклянном капилляре черезобъектив 901,25 с масляной иммерсией, а пик А - на той же суспензииклеток, но в режиме анализа в струе 45в воздухе: эпи-возбуждение и сборфлуоресценции происходили через объектив 40"0,65 в струе ввоздухе привыходе последней из капилляра.,Остальнье условия анализа в обоих случаях были одинаковыми. С,Ч. - коэфЙициент вариации интенсивности флуоресценции,На фиг. 3 представлены гистограммы распределения суспензии культуры 55клеток глиомы человека по содержаниюДНК (по оси абсцисс - интенсивностьФЙлуоресценции клеток (отн. ед;), пооси ординат - количество клеток),Гистограмма А получена на исходной суспензии клеток, подвергнутой сортировке. Гистограммы Б и В представляют распределение клеток по содержанию ДНК в суспензиях, полученных в результате сортировки клеток исходной суспензии на фракции, соответствующие по содержанию ДНК пикам 1 и 2.Изобретение осуществляется следующим образом.Свет от источника света 1 собирается коллектором 2, проходит через светофильтр 3, служащий для выделения возбуждающего света, и направляется интерференционной светоделительной пластинкой 4 в иммерсионный микро- объектив 5. Исследуемая суспензия кле. ток, предварительно окрашенных Йлу- Оресцентным красителем, вытекает из проточной камеры 6 через стеклянный капилляр , ось которого расположена в поле зрения иммерсионного микро- объектива 5. Возбуждающий свет вызывает флуоресценцию клеток, свет которой собирается микрообъективом 5, проходит через светофильтр для выделения флуоресценции 8 и поступает на ФЭУ 9. Сигналы Йлуоресценции клеток преобразуются в электрические импульсы и подаются в систему анализа и управления сортировкой 10,На выходе капилляра 7 формируется. струя в воздухе, несущая клетки. Пьезоэлектрический преобразователь 11, механически связанный с проточной камерой 6, разбивает струю на капли, После появления клетки с интересующими флуоресцентными параметрами система анализа и управления сортировкой 10 вырабатывает прямоугольный импульс, задержанный по времени рт момента регистрации даннойо клетки на время, необходимое ей для достижения точки разбиения струи на капли, В течение импульса образуется 4-5 капель, в одной из которых находится клетка, которую надо отсортировать, Импульс заряжает струю, и в результате отделяющиеся капли оказываются заряженными, и, двигаясь между отклоняющими пластинами 12, в постоянном электрическом поле, отклоняются и попадают в резервуар 13 для сбора клеток.Прибор изготовлен на базе люминесцентного микроскопа МЛ, В качестве источника возбуждающего света применена ртутнаялампа сверхвысокого3 1267 давления ДРШ-2, питаемая от источника постоянного тока ИПМ. Возбуждение и сбор флуоресценции производитея через микрообъектив 90" 1,25 с масляной иммерсией. Выход проточной камеры выполнен в виде цилиндрического капилляра, Для данного микрообъектива использован капил- ляр с внутренним около 150 мкм и наружным около 450 мкм диаметром. Флу оресценция клеток регистрируется с помощью фотоэлектронного умножителя ФЭУ.Система амплитудного анализа и управления сортировкой содержит мно гоканальный амплитудный анализатор АИ-95, блок формирования задерж-. ки зарядного импульса, ультразвуковой генератор для питания пьезоэлектрического преобразователя и источника высокого напряжения, подаваемого на отклоняющие пластины. В качестве резервуара для сбора клеток применены центрифужные пробирки объемом 5 мл. Проточная камера, отклоняющие 25 пластины и резервуар для сбора клеток крепятся на предметном столике микроскопа, Выведение объектива на ось капилляра производится с помощью препаратоводителя. 30На данном проточном цитофлуориметре-сортировщике клеток было оценено увеличение чувствительности предлагаемого устройства по сравнению с прототипом, На фиг 2 показаны резуль: 35 таты анализа суспензии лимфоцитов мыши, окрашенных ДНК - специфичным красителем. Пик Б получен при возбуждении и сборе флуоресценции через микрообъектив 90 " 1,25 с масляной 40 иммерсией в капилляре. Пик А получен на той же суспензии клеток, но в режиме анализа в струе в воздухе, сход" ным с режимом, примененным в прототйпе: эпи-возбуждение и сбор флуорес 231ценции происходили через суховоздушный микрообъектив 400,65 (в прототипе 320,60) в струе в воздухе при выходе последней из капилляра. Остальные условия эксперимента в обоих случаях одинаковы. Сравнение величин сигналов флуоресценции и коэффициентов вариации, рассчитанных для пиков А и Б (фиг. 2), показало, что чувствительность предлагаемого устройства приблизительно в 9 раз выше по сравнению с чувствительностью про тотипа при одновременном увеличении точности анализа, определяемой по коэффициенту вариации приблизительно в 3,5 раза.На проточном цитометре"сортировщике клеток была проведена сортировка суспензии клеток по содержанию ДНК (фиг. 3), Чистота отсортированных фракций (Б, В) составила 93 .Ф о р м у л а изобретенияПроточный цитофлуориметр-сортировщик клеток, содержащий узел эпивозбуждения и сбора флуоресценции, на выходе которого установлен микрообьектив, проточную камеру с гидродинамической фокусировкой суспензии клеток, корпус которой механически свя зан с пьезоэлектрическим преобразова. телем, систему анализа и управления сортировкой клеток, причем,на выходе камеры установлена система сбора и разделения клеток, о т л и ч а - ю щ и й с я тем, что, с целью увеличения чувствительности и точности измерений флуоресценции, выход про-, точной камеры выполнен в виде капилляра, ось которого расположена в поле зрения микрообъектива, выполненного.иммерсионным и высокоапертурным.267231 1000 190 000 аю Фиг Составитель Н.Зороведактор Т. Митейко Техред И.Иоргентал Корректор Е ко Тираж 778 ВНИИПИ Государственн по делам изобрете 5, Москва, Ж, РаЗакаэ 5755/38 Подписноеого комитета СССРний и открытийушская наб., щ, 4/5 13 оиэводственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектна 9 р- ЛЮ Яф/77 бии(ачщФ)