Способ получения ферментного фотографического материала и способ получения изображения на нем

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 4,А 80119 5 ц 4 О 03 С 1/72 ГОСУД АРС ПО ДЕЛА Й КОМИТЕТ СССР РЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ермента, о тему чтоф томатериала, увствительно ения, подлож ором л и р и сия фоветочображ а удешевлния егочества пов у предваором азиактивноймолекулярраже ния ом мате- нировапрояв-,ных растс я тем,ства изо- проявледопол"ляют вительно(46) 15.11.85. Бюл. Р 42 (71) Новосибирский институт органической химии СО АН СССР и МГУ им. М.В. Ломоносова(56) Авторское свидетельство СССР М 439780, кл. 0 03 С 1/72, 1974,Авторское свидетельство СССР . У 595693, кл. С 03 С 1/40, 1978, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ФОТОГРАФИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗОБРАЖЕНИЯ НА НЕМ. (57) 1. Способ получения ферментно; го фотографического материала, включающий обработку полимерной подлож" рительно обрабатывают растда, а фермент используют вформе, не содержащей высокных агрегатов.2. Способ получения изона ферментном фотографичесриале, включающий его экспние ультрафиолетовым светоление и закрепление в водворах, о т л и ч а ю щ и йчто, с целью повышения качбражения, закрепляют переднием в растворе, содержащемнительно детергент, а прояврастворе, содержащем дополнреагенты гистохимической визации фермента, 1191874Изобретение относится к бессереб-, ряной фотографии, точнее к фотоматериалам для получения полутоновых черно-белых и окрашенныхизображенийе 5Цель изобретения - удешевление фотоматериала, повышение его свето- чувствительности и качества изображения.Способ получения ферментного фотографического материала осуществляется следующим образом.Приготавливают полимерный листовой материал, несущий светочувствительные реакционноспособные группы. 15 Для этого полимерную подложку, например целлюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, фосфоцеллюлозу, желатину или карбоксиметилсефадекс, модифицируют бифункциональными фотореаген тами с помощью реакций алкилирования или ацилирования. В качестве би" функциональных фотореагентов используютароматические азиды, содержашие я-хлорэтиламиногруппы, карбоксильные амико- и другие реакционно- способные группы, модифицирующие полимерную подложку.Наносят на подложку раствор активного фермента, например щелочной 30 фосфотазы, лактатдегидрогенаэы, пер.оксидазы, субтилизина, Ы-химотрипсина и др. (предварительно раствор фермента фильтруют через полимерный носитель для удаления сильно сорбирующихся агрегатов )и высушивают.Способ получения изображения; на полученном, как описано, выше фотоматериале осуществляется следующим образом. 40Фотоматериал экспонируют через галогеносеребряный полутоновый негатив или через трафарет с помощью ртутных ламп ДРШили БУФ. В результате фотораэложения ароматичес ких азидов с образованием высокореакционноспособных нитренов в экспо-. нированных участках фермент ковалентно и неспецифично, т.е. не по активному центру, присоединяется к поли мерной матрице беэ заметного уменьшения своей каталитической активности.Закрепляют скрытое изображение вымыванием несвязанного фермента, 55 например обрабатывают буферным раствором с большой ионной силой, содержащим поверхностно-активные вещества, например 0,1 М НС 1, 1 И ИаС и "Тритон Х". В результате ковалентло не связанный фермент переходит в раствор и на подложке образуется стабильное скрытое изображение, состоящее из фотоиммобилизованного фермента.Проявляют скрытое изображение методами гистохимической визуализации ферментов, т.е, обрабатывают водными растворами хромогенных. субстратов, специфичных для данного фермента, например Ы-нафтилфосфат для фосфотазы, Н 02 с о-дианизидином для пероксидазы, индоксилбутират для субтилизина и др, В результате ферментативных реакций в местонахождении последнего происходит накопление красителя, что и приводит к образованию видимого изображения.Предлагаемый способ применим к ферментам практически всех классов, поскольку в указанных условиях к подложке ковалентно присоединяются любые белки, находящиеся на полимерном носителе. Это определяется способностью ароматических аэидов при облучении УФ-светом давать высокореакционноспособные частицы - нитрены, способные модифицировать практически все типы химических связей, причем квантовый выход фотолиза ароматических азидов в полосе поглощения близок к единице. Выбор подложек с ковалентно присоединенными азидогруппами весьма широк.Многообразие. методов гистохимической визуализации каталитически активных ферментов позволяет получать изображение любого цвета, в том числе и черно-белое. Другими достоинствами предлагаемых способов яв-. ляются легкость получения полутонового изображения и возможность ис- пользования ферментативных препаратов низкой степени очистки, что значительно снижает стоимость фотоматериала. Изобретение иллюстрируется примерами с ферментами классов гидролаз и оксидоредуктаз. Во всех примерах, если это специально не оговорено в тексте, растворитель - вода, температура комнатная (20-25 С).Пример 1.а) Получение светочувствительного полимерного материала.10 35 50 ферментативной реакции с солями ди-,азония при комнатной температуре0,1-1 ч в растворе, содержащем:сНафтилфосфатнатрия, мг 5Диазоль синий2 С, мг 121 мМ трис: НС 1,1 М БаС 1,мММЫС 2, 10 МЕпс 11 рн 9,6,10После проявления получают чернобелое изображение, которое многократно промывают водой и сушат.Пример 3,а) Получение полимерного светочувствительного материала.Светочувствительную карбоксиметил"целлюлозу получают, как в примере 2 а.б) Нанесение фермента на светочувствительный материал.10 мг пероксидазы из хрена ("Веапв 1", ВНР) с активностью 400 ед./мграстворяют в 100 мл 01 М ацетатанатрия, рН 5,0, и фильтруют черезкарбоксиметилцеллюлозу. Светочувст-,вительный носитель погружают на1-3 с в раствор фермента и промакают фильтровальной бумагой.в) Получение скрытого изображения.фотоматериал экспонируют, как в.примере 1 вг) Закрепление изображения.Экспонированный образец отмываютот несвязанного фермента при 2037 С дважды по 15 мин раствором 1о40примера 1, затем 15 мин 0,1 М КБО,0,1 М раствором ацетата натрия, рН5,0.д) Проявление.Закрепленное скрытое изображение45из фотоиммобилизованной пероксидазы проявляют при комнатной температуре 0,5-1 ч в растворе, содержащемМЛ0,01 М о-дианизидин в этаноле 10,1 М ацетат натрия, 1 мМ СаС 1,рН 5,0 10ЗХ-ная перекисьводорода 0,5Получают темно-коричневое изображение на белом фоне, которое 3=. 4 раза по 2-3 мин промывают водой и сушат.Пример 4.а) Получение полимерного светочувствительного материала.Задубленный желатиновый слой фотопластинки с отмытым галогенидом серебра смачивают раствором Б-метил-Б-(2-хлорэтил)-и-азидобензиламин гидрохлорида в абсолютном метаноле ,(50 мг/мл) из расчета 0,1 мл/см 2 и термостатируют 12 ч при комнатной температуре. Алкилированный желатн новый слой последовательно промывают в течение 1 ч 1 М БаС 1, 3-4 раза по 2-3 мин водой и сушат на воздухе,Нанесение фермента, получение скрытого изображения, закрепление его и проявление проводят, как в примере 2 б, в, г, д.Пример 5.а) Получение полимерного светочувствительного материала.Лист хроматографической бумаги ФН(8 х 40 см) помещают в колбу1на 500 мл и приливают раствор и-нитробензоилхлорида (11 г) в 450 мл пиридина, Реакционную смесь нагреваютодо 80 С и выдерживают при этой температуре 6 ч. После этого пиридиновый раствор сливают, а бензоилированную целлюлозу трижды промывают разбавленным раствором Н БО, 3-4 раза по 2-3 мин водой, вымачивают 1 ч в 0,01 М МаСО, опять промывают водой, затем ацетоном и сушат на воздухе. Восстанавливают и-нитробензойный эфир целлюлозы 15 .мин при 60 С в растворе, содержащем 500 мл 5 Е- ного раствора сегнетовой соли в воде: 1 О мл 157,-ного раствора ТС 1. и-Аминобензойный эфир целлюлозы 3- 4 раза по 2-3 мин промывают водой, этанолом и сушат на воздухе. Диазотирование материала проводят приф0,2 С в течение 0,5 ч в растворе 3 г 11 аЮ 2 в 100 мл, О, 01 М НС 1. Эту и последующие операции проводят в затененном месте, После этого бумагу промывают ледяной водой и помещают в раствор 2,5 г Ба 11 в 0,01 М НС 1 на 0,5 ч при 0-5 С. Светочувствительный о-аэидобензойный эфир целлюлозы 3-4 раза по 2-3 мин промывают водой, затем ацетоном и сушатНанесение фермента, получение скрытого негативного изображения,з 119874Лист фосфоцеллюлозы (УаСшап Р 81)в ГН+-форме промывают трижды в 1 Мрастворе йаС по 15 мин, затем 34 раза водой по 2-3 мин и сушат навоздухе, Полученйую натриевую сольфосфоцеллюлозы помещают в плоскодонную прямоугольную кювету, наносятраствор Г 1-метил-Г 1-(2-хлорэтил)-и-азидобензиламин гидрохлорида в абсолютном метаноле (30 мг/мл) из расчета О0,1 мл/см . Эту и последующие операции проводят в затененном месте илипри красном свете. Кювету термостатируют в течение 3 ч.при 50 С. Модифицированную фосфоцеллюлозу последовательно отмывают в 1 М ИаС 1 1 ч,3-4 раза водой по 2-3 мин, 1 ч этанолом, ацетоном и сушат.б) Нанесение фермента на светочувствительную подложку. 20Суспензию лактатдегидрогеназыиз мышц свиньи ("Веапа 1", ВНР), концентрация О мг/мл, активность 2 ед//мг, в 3 М (И 11) 80 разбавляют в1 О раз 1 М раствором трис: НС, рН 258,0. Полученный раствор фильтруютчерез Фосфоцеллюлозу. Светочувствительный материал погружают на 1-3 с 1в фильтрованный раствор фермента ипромакают фипьтровальной бумагой.в) Получение скрытого негативного иэображения.Полученный фотоматериал экспонируют через негатив полным спектромДРШ0,2-4 мин с расстояния 15 см35или тремя лампами БУфв течение10-20 с через трафарет с расстояния Р40 см. иг) Закрепление проводится прил20-37 С дважды по 15 мин раствором 400,1 М трис: НС 1, 1 М ИаС 1, 1 мМ иМдС 1, 10 2 пС 1, 5 г/л "Тритон-Х100", рН 8,5 (раствор 1), затем15 мин раствором 1 Г 1 фосфата натрия, нрН 7,5.45д) Проявление,50 55 рия, мл Отмытое от несвязанного Ферментаскрытое изображение проявляют при37 С в течение 0,5-1 ч в растворе,содержащем:Никотинадениндинуклеотид,мг 20Феназинметасульфат, мг 21 М лактат натНитротетразолиевый синий,мг 300,1 М фосфатнатрия, рН 7,4,мл , 100После проявления получают фиолетовое изображение на белом фоне, которое 3-4 раза по 2-3 мин промываютводой и сушат.Пример 2.а) Получение светочувствительногополимерного материала.Лист карбоксиметилцеллюлозы (Ма 1 шап СМ 82) в Нф 3 -форме на 15 минпогружают в 0,01 И раствор ЯаОН, выдерживают 1 ч в 1 М ГаС и сушат прикомнатной температуре. Полученнуюнатриевую соль карбоксиметилцеллюлозы в кювете смачивают раствором ал-килирующего фотореагента Г 1-метил-Б-(2-хлорэтил)-и-азидобензиламин гид-рохлорида в абсолютном метаноле(30 мг/мл) из расчета 0,1 мп/см . Этуи последующие операции проводят взатененном месте. Кювету термостатиоруют 3 ч при 50 С. Далее промываютч в 1 М ИаС 1, 3-4 раза по 2-3 минв воде, 1 ч в этаноле, ацетоне и сушат.б) Нанесение фермента на свето- "чувствительный материал.50 мг щелочной фосфотазы из кишок цыплят ("Беапа 1", ВНР) с активностью 0,4 ед/мг растворяют в 00 мл .раствора 1 мМ трис: НС 1,М БаС,Н 8,2, добавляют 1 О г (Г 1 Н 1,)804,фильтруют через карбоксиметйлцелюлозу. Модифицированную подложку на-3 с погружают в раствор ферментапромакают фильтровальной бумагой.в) Получение скрытого изображения.Приготовленный Фотоматериал экспоируют через негатив лампой ДРШ течение 1-4 мин с расстояния 15 смили тремя лампами БУФв течение15-20 с через трафарет с расстояния40 см. г) Закрепление изображения проводят при 20-37 С дважды по 15 минраствором 1 примера 1,затем 15 минраствором 1 мМ трис: НС 1, 1 М БаС 1,1 мМ МяС 1, 10 2 пС 1, рН 9,2.д) Проявление,Закрепленное скрытое изображениеиз фотоиммобилизованной щелочнойфосфотазы проявляют методом одновременного азосочетания продуктов,0 3 0,00015 0,20 4 0 О,005 1,10 закрепление его и проявление проводят, как в примере 2 б, в, г, д.Пример 6,а) Получение полимерного светочувствительного материала.и-Азидобензойный эфир целлюлозы получают, как в примере 5 а.Нанесение фермента, получение скрытого изображения, закрепление его и проявление проводят, как в примере 1 б, в, г, д. Приме р 7.а) Получение полимерного светочувствительного материала.и-Аэидобензойный эфир целлюлозыполучают, как в примере 5 а.б) Нанесение фермента на светочувствительный материал.20 мг субтилизина из Васх 1 ця яцЬ 11 хя с активностью 12 ед./мг растворяют в 100 мл 0,05 М СаС 1, О, Мтрис: НС 1, рН 7,0. Раствор фермен-,та фильтруют через карбоксиметилцеллюлозу и пропитывают им носитель,Фотоиммобилизацию фермента и отмывку несвязавшегося фермента проводят, как в примере 2 в, г.д) Проявление.Закрепленное скрытое иэображение из фотоиммобилизованного субтилизина проявляют в течение 0,5-1 ч при комнатной температуре в раство ре, содержащем 0,1 М КС 1; 0,05 М СаС 1, 0,1 М трис: НС 1, 157.-ный метанол, рН 7,8; 0,1 мМ индоксилбутират. После проявления получают голубое изображение на белом фоне, ко- торое 3-4 раза по 2-3 мнн промывают водой и сушат,Пример 8.а) Получение полимерного светочувствительного материала.0,5 г СМ-сефадекса Св 50 млдистиллированной воды в присутствии0,05 г реактива Вудворда инкубируют1 ч на качалке, затем добавляют 0,1 г.и-фенилендиамина и инкубируют в течение 3 ч при 20 С. Носитель промыва" О ют на стеклянном. фильтре попеременноводой и 1 М ИаС до обесцвечиванияпромывной воды. К полученной подлож"ке добавляют 0,5 мл концентрированной НС в 50 мл воды и медленно 15 перемешивают в течение 0,5 ч. При0-5 С добавляют раствор 0,2 г НаМОв 1 мл НО. Через 0,5 ч избыток азо- .тистой кислоты разрушают мочевиной.и приливают раствор 0,2 г Май вмл 2 О Н О. Реакционную смесь перемешиваютеще 0,5 ч. Модифицированный СМ-сефадекс 3-4 раза по 2-3 мин промывают водой в затененном месте и сушатна воздухе. Сухой светочувствительный д гель наносят на клейкую поверхность.б ) Нанесение Фермента на светочувствительный материал.20 мг о-химотрипсина быка с активностью 7,5 ед./мг растворяют в100 мл 1 мМ НС 1 и фильтруют черезкарбоксиметилцеллюлоэу, светочувствительный гель пропитывают раствором Фермента из расчета 200 мг фермента на 1 г геля.Фотоиммобилизацию фермента,закрепление скрытого изображения и егопроявление проводят, как в примере 7 в, г, д.Сенситометрические характеристи О ки Фотоматериалов, полученных и отобранных в соответствии с примерами 1-8, приведены в таблице.