Способ определения термостабильного -экзотоксина bacillus тнuringiеnsis

(71) Всесоюзныйский институт игии юл. У 21аучно-исследователькладной микробиолотся к микрочнее к спосоиохимии, т я и очистк веществ из угого вида микробиоло сырья, Дел ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТЕРМОСТАБИЛЬНОГО ф -ЭКЗОТОКСИНА ВАС 1 ЬЬПЯ ТНПК 1 ИС 1 ЕБЯ 18(57) Изобретение относибиологии и бобам получени и биологически активных гического и др ь изобретения - повьппение точности иускорение способа, Для этого культуральную жидкость, содержащую Р -экзотоксин, пропускают через диализную мембрану с последующим электрофорезом в потоке буфера, содержащего0,01-0,015 М фосфат, рН 7,0-8,0,при плотности тока О, 1-0, 12 А/см,времени разделения 150-200 с и скорости подачи фильтрата 0,02-0,05 см/После пропускания культуральной жидкости через диализную мембрану с помощью ультрафильтрационной ячейки,-экзотоксин освобождается от клетоки высокомолекулярных компонентовсвыше 1000 дальтон, Фильтрат далееразделяют в электрофоретической камере, выделяя пик, содержащий чистыйИзобретение относится к областимикробиологии и биохимии, в частности к способам получения и очисткибиологически активных веществ из5микробиологического и другого видасырья.Цель изобретения - повышение точности и ускорение способа,Культуральную жидкость, содержащую-экзотоксин, пропускают черездиализную мембрану с последующимэлектрофорезом в потоке буфера, содержащего 0,01-0,015 М фосфат,рН 7,0-80, при плотности тока 0,1- 150,12 А/см , времени разделения 150200 с и скорости подачи фильтрата0,02-0,05 см/с. При этом после про-пускания культуральной жидкости через диализную мембрану с помощью 20ультрафильтрационной ячейки-экзотоксин освобождается от клеток и высокомолекулярных компонентов свыше1000 дальтон, Затем фильтрат подвергают дальнейшему разделению в электрофоретической камере. В результатепоследовательного использования этихметодов удается выделить пик, содержащий чистый ф -экзотоксин, Концентрацию экзотоксина определяют по калибровочной кривой поглощения на длине волны 260 нм в кювете с оптическимпутем 10 мм.На фиг. 1 показана принципиальнаясхема выделения ф -экзотоксина изкультуральной жидкости;. на фиг, 2 - 35график распределения вещества послеэлектрофореза в свободном потоке навыходе из камеры разделения, нафиг. 3 .- зависимость оптической плотности от концентрации у -экзотоксина,Устройство для выделения-экзотоксина содержит ультрафильтрационную ячейку 1, диалиэную мембрану 2,баллон 3 с сжатым газом, проточнуюэлектрофоретическую камеру 4, электродные отделения 5, коллектор 6 снабором пробирок и емкость 7 для несущего буфера.П р и м е рЧерез ультрафильтрационную ячейку 1 с диализной мембраной 2 площадью 5 см пропускают культуральную жидкость. Фильтрацию проводят с помощью баллона 3 со сжатымазотом при давлении порядка 6-7 атм,Объемная скорость фильтрации при этомусоставляет 0,01 см/мин, При скорости фильтрации 0,02 см/мин получаютаналогичный результат. С этой же ско, ростью фильтрат подают в электрофоретическую камеру 4, в которой через электродные отделения 5 от источника питания подается постоянное электрическое напряжение. При этом в камере протекает электрический ток с плотностью 0,1 А/см , что обеспечивает оптимальное выделение экзотоксина иэ фильтрата при времени разделения 2,5 мин. Аналогичный результат получают при плотности тока О, 12 А/см,2 В качестве электрофоретический камеры используют ячейку с размерами 300 кбОк 0,5 мм.Несущий буфер 0,01 М триэтаноламинфосфат с рН 7,5 непрерывно подается в рабочий зазор камеры из емкости 7, Образец (фильтрат культу- ральной жидкости) и поток несущего буфера непрерывно отбирается на выходе из камеры с помощью коллектора 6 с набором пробирок, После отбора фракций по 2 мл в отдельные пробирки с помощью спектрофотометра в кювете толщиной 10 мм на длине волны 260 нм определяют распределение оптической плотности вдоль электрического поля камеры . На фиг. 2 показан результат распределения вещества после электрофореза в свободном потоке на выходе из камеры разделения, Стрелкой указано место ввода образца в камеру. Из рисунка видно, что вещество на выходе из камеры распределено в виде трех пиков, имеющих разное отклонение вэлектрическом поле и отличающихся поЭФП.1С помощью метода тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинках "Бх 1 иГо 1" установлено, что третий пик на кривой распределения оптической плотности соответствует чистому 5 -экзотоксину, следовательно, экзотоксин имеет максимальную ЭФП в сравнении с остальными компонентами фильтрата.Получаемый препарат р -экзотоксина электрофоретически и хроматографически чист и не содержит примесей.Специальные биологические тесты показывают также, что выделенный препарат экзотоксина обладает биологической активностью. По суммарной величине поглощения в третьем пике и с использованием калибровочной кривой поглощения в кювете 10 мм на длине волны 260 нм для чистого-экзотоксина определяют концентрацию экзотоксина в пике с точностью ф 10 . (фиг, 3).14010424 Для данного случая концентрация-эк- ф о р м у л а и з о б р е т е н и я зотоксина составляет 0,045 мг/мл,Способ определения термостабильПредлагаемый способ выделения ного-экзотоксина Вас 11 цз сЬогп-5 позволяет повысить выход термостабиль- цепзз путем очистки культуральной ного р -экзотоксина до 98-997 вместо жидкости с последующей идентификаци-307. по известному способу, ловы" ей и спектрофотометрией о т л и -У сить точность количественного бпреде- ч а ю щ и й с я тем что с цельюУ У ления ф -экзотоксина в культуральной 10 повышения точности и ускорения спосожидкости до 103 вместо 503 и сокра-ба, очистку проводят ультрафильтратить в два раза минимальное время, цией через диализную мембрану с по- необходимое для определения экзоток- следующим электрофорезом в свободном сина (до 20 мин), Указанное время потоке буфера, содержащего 0,01- можно уменьшить до 5 мин, если испольб 0,005 М фосфат рН 7,0-8,0 при плотзовать на выходе из камеры разделения . ности тока 0,1-0,12 А/см, времени проточную кювету спектрофотометра разделения 150-200 с и скорости пода- объемом 0,1-0,2 смчи фильтрата 0,02-0,05 см/с. длтичИкаю малююсьЮд1401042 Составитель А,АгуреевТехред М.Дидык Корректор В Редактор Н,Яц ж 520 Подпис по д113035, М Проектная,Произво нно-полиграфическое предприятие, г. Ужгор ЕИО аююесхая ллот- мсюь Заказ 2768/26ВН осударственного комитета СССРам изобретений и открытийква, Ж, Раушская наб., д,0050 канцеищрацоя юг/ю