Способ выращивания клубеньковб1х

293785 Сооа Советских Социалистических РеспуоликЗависимое от авт. свидетельства МЗаявлено 05 111,1969 ( 1329249/30-15)с присоединением заявки МПриоритет С 051 11/08 Комитет по делам зооретений и открыти при Совете Министров СССРОпубликовано 261971. Бюллетень МДата опубликовая описашя 22.11.197 УДК 631.86:631.461,5АвторыизобретеЗаявител В. С. Краснопольская, Т. Б. Плаксина и Т, В, Шмырева Всесоюзный научно-исследовательский институт микробиологических средств защиты растений и бактериальных препаратовПАТБННВ.1 БХИИЧбСКОСОБ ВЫРАЩИВАНИЯ КЛУБЕНЬКОВЪХ БАКТЕРИИ БИБЛИОТЕКАЛУПИНА И СОИ 2 сухого нитрап клубеньковых нпя 48 час. П нитрагина вкл щпвание бакт ношении соста нпя, позволяю титры, приобр на толькбактерийереход кючает бо. риальной в средыцие полуетают ва о из быстрорастущих с циклом выращивапроизводству сухого ее интенсивное выра- массы. И в этом оти условия выращивачать более высокие ное значение. Изобретение относится к области производства бактериальных препаратов сельскохозяйственного назначения и может быть использовано для приготовления сухого бактериального удобрения нитрагина под культуры лупина и сои.Для районов стародавнего возделывания бобовых прибавка от использования нитрагина составляет в среднем 15 - 25%. Для культур новых в данном районе, для которых в почве нет спонтанных клубеньковых бактерий, эффект от применения нитрагина значительно выше 100% и более.Известно, что виды клубеньковых бактерий специфичны к растению-хозяину. По скорости роста на питательных средах они делятся на две группы - быстрорастущих и медленно- растущих. Клубеньковые бактерии лупина (КЬкоЫцгп 1 црп) и сои (КЫгоЬшпаропсшп) относятся к медленнорастущим бактериям.Нитрагин под лупин и сою в настоящее время производят на заводах только в виде почвенного препарата. Между тем способ производства почвенного нитрагина, основанный на размножении маточной культуры клубеньковых бактерий в почве, слабо механизирован и вытесняется более прогрессивным способом производства сухого нитрагина, Однако последний способ предусматоивает производство 10 Выращивание быстрорастущих клубеньковых бактерий производят на среде с кукурузным экстрактом, сахарозой и благоприятными для этих бактерий исходной реакцией среды (р.1 6,8 - 7,0) и режимом аэрации (0,4 г/кас и 15 более кислорода на 1 л среды илп 1 л возду- ха на 1 л среды в 1,цик). Этот способ может быть прюенен также для выращивания медленнорастущпх клубеньковых бактерий, но он не является оптимальным для этих бактерий 20 и дает низкий выход биомассы. Бобовый отвар, широко применяемый в лабораториях и при выращивании маточной культуры клу.беньковых бактерий при производстве почвенного нптрагпна, является средой, еще более не 25 отвечающей требованиям медленнорастущихклубеньковых бактерий.Цель изобретения в разработ способа выращивания медленнорастущпх клубеньковых бактерий сои и лупина с хорошим выходом 30 биомассы.Аэрация,г/час Она 1 лсредыфф Состав среды, об Среда ЙЫхоЫцв 1 цр 1 п 11 хЫхоЫит ароп 1 спгп 0,15 9300 Кукурузный экстракт 0,6, минеральная основа фглюкоза 1,0рН 60Бобовый отвар КгНР 01 0,05 Сахар 1,0 рН 70Кукурузный экстракт 0,6 Минеральная основаСахар 1,0 рН 70Кукурузный экстракт 0,5 Дрожжевой экстракт 0,3Минеральная основа фСахар 1,0 ХаНСО, 0,03 рН 7,0 6700 Для медленнорастущихклубеньковых бакте- рий 0,4 Бобовый отвар 650 700 0,4 1660 1120 Регламентная 0,4 1150 1110 По авт. св. 1 Ча 161180 ф Минеральная основа, % К 2 НРО 4 0,05; (ХН 4)504 0,05; ХаС 0,02; МОЮ 4 0,02;мел 0,1.фф Инокуляция 40 млн/ил, температура 28 С. Одной изизвестных физиологических особенностей": медленнорастущих клубеньковых бактерий является подщелачивание питательной среды Фотличие. от быстрорастущих, которые ее подкисляют. Эта особенность была учтена при разработке предлагаемого способа. Уровень защелачивания среды зависит от ряда факторов и может явиться тормозом дальнейшего развития культуры. Так, на среде с сахарозой происходит подщелачивание культу- ральной жидкости до 8 и выше единиц рН и остановка размножения после двух-трех суток, когда количество клеток достигает только 1 -1,5 млд/мл.Согласно предлагаемому способу поставлен. ная цель достигается снижением уровня щелочности в ходе развития культуры путем подкисления исходной реакции среды до р 1-1 около 6,0, введением в питательную среду глюкозы, которая является не только благоприятным источником углерода для клубеньковых бактерий лупина и сои, но и фактором регулирования реакции среды, и снижением аэрации до 0,1 - 0,2 г/час кислорода на 1 л среды.На среде с кукурузным экстрактом и глюкозой при переходе культуры клубеньковых бактерий лупина и сои в фазу замедления роста происходит перелом кривой рН от щелочного максимума (рН 7,3 - 7,5) в кислую сторону, размножение продолжается в течение 4 - 6 суток, и максимальная концентрация клеток достигает порядка 7 12 ллд/л 1 л.Предлагается способ выращивания клубеньковых бактерий лупина и сои на питательной среде, содержащей кукурузный экстракт, ми. неральные соли калия, натрия, магния, кальция и фосфора и источник углерода при аэрации и температуре предпочтительно 27 - 29 С, При этом способе в качестве источника углерода и регулятора реакции среды берут гл 1 окозу, реакцию среды доводят до рН 6,0 - 6,2, а аэрацию поддерживают из расчета 0,1 - 0,2 г/иас кислорода на 1 л среды.Предлагаемый способ был апробирован в 5 лабораторных и заводских условиях и показал, что он позволяет получать выход живых клеток КЫгоЬ 1 цгп 1 цр 1 п 1 и КЬ 1 гоЬшгп 1 ароп 1- сцгп в 6 - 10 раз больше, чем при использовании известных ранее способов выращивания 10 клубеньковых бактерий.В табл. 1 приведены титры бактерий послечетырех дней глубинного культивирования.Выращивание медленнорастущих клубеньковых бактерий предлагаемым способом даст 15 снижение себестоимости урожая бактериальной массы в 6 - 10 раз по сравнению с другими способами, приведенными в таблице.Пример осуществления способа.Приготовлено 1,3 л питательной среды со гласно прописи: 7,8 г кукурузного экстрактарастворили в 1 л водопроводной воды. Пос.ле кипячения в течение 20 лаан отфильтровали, довели объем до 1 л, внесли по 13 мл 5%-ных растворов (МН 4) гс 104 и К 2 НРО и 2%-ных 25 растворов МаС и Мдс 104, добавили 13 г глюкозы, довели объем воды до 1,3 л. рН 6,20.Добавили 1 мл 7%-ной НС 1 до рН 6,05. Разлили в три колбы для выращивания на 750 мл по 400 л 1 л среды и добавили по 400 мг мела 30 и в колбу на 250 мл со 100 л 1 л среды без добавления мела - для получения яидкого посевного материала. Среду простерилизовали - большие колбы при 1 атл 1 в течение 45 лаан, малую при 1 атм в течение 20 лчин.35 Определили в отдельной пробе рН средыпосле стерилизации 5,98.В малую колбу внесли смыв с одного косякаКЬ 1 гоЬшгп 1 цр 1 п 1, штамм 359 а. Колбу поставили на малую качалку со 150 обчин при тем пературе 28 С. Через трое суток инкубации293785 Таблица 2 Титр, млн/.ил рН конечУ колбы ный по подсчету по высеву 6,15 6,13 6,12 7100 7100 7300 940010200 Среднее 6,13 7200 9800 Составитель М. Дранишников Редактор Н. С. Старостина Текред Л. В. Куклина Корректор Л. А. ЦарьковаЗаказ 1026/12 Изд, М 430 Тираж 473 Подписно ЦИИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР Ъосква, Ж, Раушская наб., д. 4 5 Типография, пр. Сапунова, 2 высеяли на чистоту (на косяк МПЛ), определили рН и титр в посевной колбе (подсчет в камере Горяева). рН 6,99, титр 2500 млн/мл. Внесли в каждую из трех опытных колб по 6,5 мл из посевной колбы, что составило 40 млн/мл. Колбы с 400 мл засеянной среды поставили на большую круговую качалку с 160 об/мик, что обеспечивало скорость растворения кислорода 0,15 г/л час. Температура инкубации 28 С. Через четыре дня выращивание закончили. Определили конечное рН в колбах,титр по камере, чистоту культуры и сделали высев на маннпто-дрожжевую твердую среду для определения количества живых клеток.Чашки Петри поставили в термостат во влаж ной камере, Через 10 дней просчитали колонии и вывели титр. Результаты приведены к табл. 2. Предмет изобретения10Способ выращивания клубеньковых бактерий лупина и сои на питательной среде, содержащей кукурузный экстракт, минеральные соли калия, натрия, магния, кальция и фосфо ра и источник углерода, прп нейтральном значении реакции среды, аэрации и температуре предпочтительно 27 - 29 С, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода биомассы, в качестве источника углерода и регулятора ре акции среды берут глюкозу, реакцию среды доводят до рН 6,0 - 6,2, а аэрацию поддерживают из расчета 0,1 - 0,2 г/час кислорода на 1 л среды.