Способ выделения пыльников сои

СОЮЗ СО СОЦИАЛИС РЕСПУБЛИ ЕТСКИХИЧЕСКИХ 1 А(з)5 А 01 Н 1(04 ЕН НИЕ И А ЕЛЕН Я ПЫЛЬНИКО тивирование клеология и инженеетения: бутоны уют в жидкой среот соматической ьной фильтрации флотации, 1 табл. ледовательгзоого ЧЧ.О. есаулцие Фог 1 п Вгаззса М 8, р, 1681 -ГОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ. СССР СКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(56) Розоп 11., Кои .5,. Веч1 агдезсае глсгозроге си 1 ыгегпмабоп. - Яе 1 есбоп иоб 1 езпарцз. Сап. Во 11988, ч. 66,1685,Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано вклеточной биологии.Цель изобретения - ускорение процесса выделения и повышение качества пыльников за счет улучшения их очистки.Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.Растения сои в фазе цветение - начало бобообразования - с корнем помещают в сосуды с жидкой питательной средой Кнопа и выдерживают в холодильнике при 0 - 10 С в течение 3 - 30 дней, При 10-20 С пыльники, достигнув фазы 1-2 ядерных микроспор, останавливаются в своем развитии, эа счет чего в дальнейшем повышается процент формирования каллуса из пыльника, Время . температурной предобработки (3-30 дней) обеспечивает ростижение фазы 1-2 ядерных микроспор большим количеством пыльников. Затем пинцетом отделяют бутоны и . стерилиэуют их в 0,1-ном растворе НдС 12 в течение 10 мин. После стерилизации всю работу ведут с соблюдением условий асептики. Простерилизованные бутоны дважды(54) СПОСОБ Вца СОИ(57) Использование: кул ток и тканей, клеточная б рия. Сущность изобр стерилизуют, гомогениэи де и отделяют пыльники ткани путем предварите через сито и последующе отмывают в 500 мл дистиллированной стерильной воды, затем помещают в емкость с .жидкостью. осмотическое давление которойблизко или равно осмотическому давлениювнутри. микроспор (5 - 10 атм). например,среда Й 6 с 9-12 сахарозы (чтобы не происходило разрушение пыльников) и измельчают с помощью мешалки РТили миксерапри 5000 об/мин в течение 10 - 15 мин, Затем отделяют измельченную ткань бутоновот пыльников флотацией, Отделенные пыльники помещают на сито с отверстиями менее 0,1 мм и отмывают от примесейдиплоидных клеток бутонов свежей питательнойсредой Йб с 9-12 сахарозы. Послеэтого пыльники используют для посадки вкультуру или иных целей,П р и м е р 1. Выделение пыльниковвручную,Выделение, посадку пыльников для индукции андрогенеза проводили при помощипрепарировальных игл из предварительнопростерилизованных бутонов,(10 мин в0,1 -ном растворе дихлорида ртутй)вусло-виях асептики по окончании трехкратной10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 промывки в 500 мл стерильной дистиллированной воды, Полноту извлечения определяли .как процентное отношение числавыделенных пыльников к числу бутонов,увеличенному в 10 раз (у сои в бутоне 10пыльников). Жизнеспособность пыльниковпри выделении вручную не определяли, таккак высокий уровень андрогенеза свиде. тельствует об очень хорошей сохранностиклеток пыльников, Загрязненность определяли после проведения посадки на чашкиПетри как процентное отношение числа частиц посторонних тканей к их сумме с числом пыльников. В результате при ручномвыделении андрогенез составил 37,03.0 о , полнота извлечения 89,9+1,8 о . загрязненность 0.9".0,6%.П р и м е р 2. Измельчение бутонов иотмывка пыльников на сите,Для выделения пыльников бутоны соиизмельчали в РТпри 5000 об/мин в течение 10-15 мин, причем измельчение проводили в изоосмотичес ком растворе(например, питательная среда М 6), Госле измельчения бутонов полученную суспензиюпропускали через последовательный рядсит с отверстиями 0,5, 0,25 и 0.1 мм, Приэтом на сите 0,5 мм остаются более крупныефрагменты тканей. мешающие последующему разделению соматических тканей ипыльников на сите 0,25 мм. Пыльники, пройдя через верхние сита. задерживаются насите 0,1 мм после двухкратного пропускания 200 мл свежей среды для удаления мелких фрагментов соматических тканей. Послетого как высадили выделенные пыльники насреду для андрогенеэа. определяем их загрязненность. а спустя месяц - процент индук ии андрогенеза, Жизнеспособностьопределяют, окрашивая пыльники амарантом. при этом мертвые растительные клеткиприобретают красный цвет, а живые клеткине окрашиваются. В результате измельчения и отмывки пыльников на сите получено:андрогенеэ 3,5+1,6 , полнота извлечения69,6+ 3,2 , загрязненность 84,4+ 1,2 о ,жизнеспособность 88,4+2,7 затраты времени на извлечении 1000 шт. пыльников0,3-0.5 ч.П р и м е р 3. Измельчение бутонов,отмывка пыльников на сите, очиста флотацией,Выделение пыльников на сите производят как описано в примере 2 но исключают,длительную отмывку на сите 0,1 мм. Отмывку заменяют флотацией, которую проводятв следующей последовательности. С сита0,1 мм смывают выделенные пыльники всосуд для проведения флотации, Смыв пыльников производят свежей изоосмотической средой, После проведения аэрации жидкости ткани бутонов, окруженные.пузырьками воздуха, находятся в поверхностном слое жидкости. После прекращения аэрации происходит оседание отдельных пыльников, тогда как осмотические ткани продолжают оставаться в приповерхностном слое жидкости. В это время удаляют верхний слой жидкости вместе с соматическими тканями. Удаляя избыток среды, доводят концентрацию суспензии до 1000-10000 шт, на 1 мл, Затем пипеткой с достаточно широким отверстием на конце отбирают нужное количество и производятрассев суспензии пыльников по поверхности агариэованной питательной среды Й для индукции андрогенеза. После посева пыльников производят подсчет процента загрязненности, подсчитывая число пыльников и фрагменты соматической ткани как это описано выше. В результате процент андрогенеза 69,9 1,4 загрязненность 36,2 ч 1,4 о , жизнеспособность 78,2+ 1,57 ь,затраты времени 0,2-0,4 ч на 1000 пыльников. П р и м е р 4. Условия по примеру 3. нофлотация в дистиллированной воде. При проведении выделения пыльниковс использованием дистиллированной водыдля флотации заметных различий не обнаружено, При этом несколько снизиласьзагрязненность и составила 30,3+2,9%, полнота извлечения 69,0+2,8. жизнеспособность 80,04-3,0 , андрогенез 4,5+1,6 , затратывремени 0,2 - 0,4 ч на 1000 пыльников.. П р и м е р 5. Условия по примеру 3, но флотация в питательной среде Гамборга ВДостоверных различий между вариантами 3 и 5 нет. В этом случае загрязненность36;02,9 , полнота извлечения 71,0+2,9,андрогенез 3,2+ 1,3 о , жизнеспособность70,3+3,4%, затраты времени 0.2 - 0,4 ч на1000 пыльников.П р и м е р 6, Условия по примеру 3, но флотация в питательной среде К 6.Выполняют по методике, изложенной в примере 3, с единственным различием - для флотации используют питательную среду М. При этом загрязненность пыльников 31,14. 2,8%, полнота извлечения 72,7 ь, 2,8 , андрогенез 2.8+1,2%. жизнеспособность 89,7+2,2, время выделения 0,2-0,4 ч на 1000.пыльников,П р и м е р 7. Условия по примеру 3, но флотация в физрастворе.В отличие от предыдущих вариантов, флотацию проводят в физрастворе МаС. (8,5 г/л), Существенных различий от вариантов1746951 Сравнительная характеристика различных способов выделенияи очистки пыльников сои Составитель В.СоловьевТехред М,Моргентал Редактор М.Кобылянска рректор М.Демчи каэ 2447 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент",.г. Ужгород, ул,Гагарина, 10 3-6 не наблюдалось, При этом загрязненность пыльников 46,0+2.7, полнота извлечения 67,7+ 2,9, андрогенез 3,3 1,3, ,жизнеспособность 72,2 3,3, затраты времени 0,2 - 0,4 ч на 1000 пыльников,Формула изобретения Способ выделения пыльников сои, включающий отбор и стерилизацию бутонов, гомогенизацию их .в жидкой среде и последующее отделение пыльников от соматическойткани, отличающийся тем, что, с целью ускорения процесса выделения и повышения качества пыльников путем 5 улучшения их очистки при сохранении жизнеспособности микроспор, отделение пыльников проводят путем предварительной фильтрации через сито и последующей флотации.